聚苯乙烯塑料暴露诱导细胞毒性效应以及小鼠胆汁酸代谢紊乱的机制研究

塑料制品被广泛用于农业、医疗、交通运输等各个领域,然而随着塑料产量与消费量的迅速上升,塑料污染也日益加重。废弃的塑料制品在环境中经风化、机械应力、紫外照射、微生物等外界因素影响发生老化,产生粒径更小的微塑料(Microplastics,MPs)与纳米塑料(Nanoplastics,NPs),同时发生材料表面基团等理化性质的改变。此外,已有研究表明,纳米颗粒的小尺寸效应与高表面活性使得其易于通过吸入、摄入、皮肤接触等方式进入人体循环系统,并迅速吸附血液中的蛋白质,形成纳米颗粒-蛋白质复合物,即“蛋白冠”。蛋白冠的形成会改变纳米材料本身的特性,从而影响后续生物学效应。同时,纳米颗粒表面蛋白冠的成分受到其粒径、表面电荷等理化特性的影响。因此,老化作用引起的表面性质改变是否会影响纳米塑料表面蛋白冠的组成与后续的细胞毒性、细胞摄取等生物学效应仍需selleck产品要进一步的研究,这将有助于人们正确认识实际环境中微纳米塑料的毒性。除了细胞层面的研究,在动物水平上探讨微纳米塑料的毒性效应同样重要。微纳米塑料的暴露会引起鱼类胆汁酸代谢的异常与小鼠肝脏内胆汁酸含量的升高,但其影响哺乳类动物胆汁酸代谢的调控机制尚不清楚。因此,需要更多的研究来证明微纳米塑料诱导小鼠胆汁酸代谢紊乱的机制,这将有利于人们进一步了解微纳米塑料如何干扰机体代谢,重视其引起的毒性效应。第一部分:本部分选用无表面修饰的聚苯乙烯纳米塑料(Polystyrene nanoplastics,PS NPs)和氨基化的聚苯乙烯纳米塑料(Aminodized polystyrene nanoplastics,PS-NH_2 NPs)作为纳米塑料模型,探究了紫外照射(UV)和臭氧(O_3)处理引起的老化对材料理化性质和血浆蛋白吸附情况的影响。首先,使用UV和O_3处理加速PS NPs和PS-NH_2 NPs的老化进程,获得老化后的聚苯乙烯纳米塑料(PS-UV/PS-NH_2-UV和PS-O_3/PS-NH_2-O_3),随后对其理化性质进行表征。用SEM观察原始和老化纳米塑料颗粒的形态,发现原始PS NPs和PS-NH_2 NPs呈球形,表面光滑,而老化后的材料表面都出现了褶皱和微小碎片。DLS分析表明老化后PS NP和PS-NH_2NPs的水合粒径变小,Zeta电位绝对值降低,PDI值增大,表明老化处理降低了材料的稳定性与均一性。FTIR光谱和XPS分析结果发现经过UV或O_3处理后,MK-1775半抑制浓度PS NPs和PS-NH_2 NPs表面总O/C含量显著增加,同时,老化后材料中的含氧基团含量有不同程度的增加。另外,与原始PS NPs和PS-NH_2 NPs相比,老化后两种材料的水接触角均显著降低,表明老化后材料表面亲水性增加,这与表面含氧基团的增加相符合。随后,我们选用小鼠血浆(MP)体外孵育的方式模拟纳米塑料进入体内后的血液循环环境,分析老化前后的PS NPs、PS-NH_2 NPs与血浆蛋白的相互作用。BCA定量结果表明孵育时间对材料表面吸附的蛋白质总量影响不大,但老化作用会引起PS-NH_2 NPs表面吸附的蛋白质总量的减少。通过SDS-PAGE检测老化前后的材料表面吸附的蛋白质发现,NPs和MP之间存在强烈的相互作用,这种相互作用与血浆蛋白浓度有一定的关联,而老化作用会改变材料的蛋白质吸附特性,此外,我们还发现老化前后材料表面蛋白质的吸附将会进一步的改变材料的粒径和电位等理化性质。以上研究结果表明,UV和O_3两种老化方式均可改变PS NPs和PS-NH_2 NPs的形貌、水合粒径、电位、水接触角等理化性质,增加表面含氧基团含量,这种变化将进一步改变材料对血浆蛋白的吸附特性与材料吸附血浆蛋白后的理化性质。第二部分:该部分主要探究老化引起的聚苯乙烯纳米颗粒理化性质和吸附蛋白冠的改变对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的毒性效应和摄取情况的影响。首先研究了老化与蛋白冠包裹对RAW264.7细胞毒性的影响。使用CCK-8测定细胞存活率,发现PS NPs及PS-NH_2 NPs对RAW264.7细胞活力的影响呈现剂量和时间依赖性。原始PS NPs和PS-NH_2 NPs对细胞的毒性较大,而老化作用和蛋白冠的包裹可以减弱PS NPs和PS-NH_2 NPs的细胞毒性。由于PS-NH_2NPs对细胞存活率的影响过大,因此在后续的实验中舍弃了对老化前后PS-NH_2NPs的进一步研究。老化前后的PS NPs暴露后,细胞的PI相对荧光强度以及LDH释放显示出与细胞毒性相应的变化,说明老化作用可以减少材料带来的细胞膜损伤。流式细胞术分析结果表明,暴露24 h后,原始和老化的PS NPs均会被RAW264.7细胞摄取,并且细胞对材料的摄取表现出时间和浓度依赖farmed snakes性。总体上,老化后的PS NPs比原始PS NPs被细胞摄取得更少,10%MP预先孵育的材料比裸露的对应材料摄取更少,RAW264.7细胞对PS-UV@MP和PS-O_3@MP的摄取比PS@MP少。为了进一步探究这种摄取减少的原因,使用LC-MS/MS检测PS、PS-UV和PS-O_3表面吸附的蛋白冠,发现与PS相比,PS-UV和PS-O_3与10%MP孵育后,表面吸附的去调理素与调理素类蛋白的相对比例增加,这可能是老化后材料细胞摄取减少的原因。此外,流式细胞术分析结果表明老化过程与血浆蛋白冠的包裹抑制了PS NPs引起的凋亡。以上实验结果表明,老化作用显著降低了PS NPs与PS-NH_2 NPs诱导的细胞毒性。老化后,材料表面理化性质的改变直接影响PS NPs的细胞膜损伤和细胞摄取,从而降低了材料的细胞毒性。此外,材料表面去调理素蛋白与调理素蛋白比例的增加使得RAW264.7细胞对PS-UV@MP和PS-O_3@MP的摄取量远低于PS@MP,因此对细胞损伤较小。同时,老化作用和蛋白冠的覆盖还会缓解材料引起的细胞凋亡。第三部分:该部分主要探究口服暴露PS MPs对小鼠胆汁酸代谢的影响及机制。我们使用C57BL/6小鼠经PS MPs浓度梯度处理(0.05,0.5,5 mg/kg/day,连续30天),实验表明,口服暴露PS MPs会引起小鼠肝脏和血清中胆汁酸含量的升高及AKP、AST等胆汁酸淤积的相关指标呈剂量依赖性上升,提示PS MPs的暴露会引起小鼠胆汁酸代谢紊乱。H&E染色和Masson染色结果表明,PS MPs暴露引起的胆汁淤积会导致小鼠肝脏组织损伤及轻微纤维化的发生。同时,血清与肝脏中脂质的代谢也受到了影响。对小鼠肝脏和肠道中胆汁酸代谢相关基因进行进一步分析发现PS MPs主要通过抑制胆汁酸外排相关基因BSEP、MRP2、NTCP的表达引起肝脏中胆汁酸的淤积,而同时PS MPs可以激活肠道组织中FXR/FGF15通路,从而抑制肝脏CYP7A1的表达,抑制胆汁酸的合成,这可能是胆汁酸淤积引起的负反馈调节。此外,PS MPs的暴露还会损伤肠道屏障,使其可以进入肝脏组织蓄积。体外实验进一步证明PS MPs的暴露会引起肝脏细胞Hep G2的损伤并使胆汁酸外排相关基因的表达显著降低。以上结果表明,口服PS MPs可以通过损伤肠道组织进入小鼠肝脏中蓄积,进而下调肝脏中胆汁酸外排相关基因的表达,造成小鼠胆汁酸代谢异常,同时引起小鼠肝脏损伤与脂质代谢异常。