糖胺聚糖是一类带负电荷的线性多糖,普遍存在于人体细胞表面和细胞外基质中。糖胺聚糖通过与蛋白酶、生长因子、细胞因子、趋化因子和粘附LY2835219抑制剂分子等多种蛋白质的相互作用而介导很多生理过程,例如蛋白质功能、细胞粘附和信号传导等。糖胺聚糖与蛋白质的相互作用可以参与或干预多种人类疾病,包括心血管疾病、传染病、神经退行性疾病和肿瘤等。由于糖胺聚糖结构的复杂性和分析工具的局限性,针对糖胺聚糖与蛋白质相互作用的研究进展仍然落后于蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用的研究。本论文主要研究了肝素类糖胺聚糖与疾病关键蛋白相互作用的分析方法和作用机制,主要研究内容及结论如下:(1)迄今为止,许多糖胺聚糖与蛋白质相互作用的案例尚未被发现,这主要是因为缺乏参与相互作用的糖胺聚糖的结构信息。我们以典型的糖胺聚糖(肝素)为例,发明了一种混合糖链的序列检测方法和系统,设计了一款测序试剂盒,并开发了一款肝素糖链序列测定的Seq-GAG软件。该方法、试剂盒及软件基于质谱技术获得肝素糖链的基本组成单元信息,通过计算获得全部理论序列及含量,该系统可用于解析复杂肝素寡糖混合物的序列,辅助科研人员对肝素类药物实现快速序列解析。(2)由于糖胺聚糖固有的结构异质性,当糖链含有某些共同的结构域时,可以与特定蛋白质上的氨基酸残基相互作用。我们建立了一种“族群”测序策略,可以推断出所有与靶蛋白具有亲和活性的寡糖序列,从而确定这些寡糖的共有序列,该共有序列则为相应靶蛋白的结合序列。为了证明该测序策略的可靠性,我们测定了抗凝血酶Ⅲ结合的肝素寡糖序列,获得了一个共有的七糖序列,该序列包含了公认的抗凝血酶Ⅲ结合五糖序列,并在五糖序列的两端进行了序列延伸。我们将该策略进一步应用到干扰素-γ的肝素结合序列的测定,发现了一段对称的高硫酸化五糖序列,肝素与干扰素-γ相互作用的分子机制也被进一步阐明。我们的策略对于发现糖胺聚糖Y-27632半抑制浓度与靶蛋白相互作用的特异性序列,并开发新的基于糖胺聚糖的治疗方法至关重要。(3)除了生物活性外,糖胺聚糖与蛋白质的结合也可能产生副作用,其中典型的案例是肝素与血小板因子4(Plateletfactor4,PF4)的相互作用。PF4与肝素或低分子肝素形成的超大复合物是诱导免疫反应及进一步引发血小板减少症的重要参与者。目前仍然缺乏关于PF4与肝素长链相互作用的全面研究和可靠的分析方法。我们采用多种方法表征了 PF4与依诺肝素钠形成复合物的特征,建立了液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和 LC-MS/MS 多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)方法,对复合物中的肝素糖链和PF4进行了定性和定量分析。本论文首次提出PF4与依诺肝素钠的结合模型,即一条肝素糖链(～dp18)与两个PF4四聚体以不同形态结合形成超大复合物,而在较小复合物中PF4四聚体被多个肝素糖链包围。本研究对PF4与低分子肝素相互作用的结构机制提供了新的见解,有助于进一步了解低分子肝素引起免疫原性的机制和开发更安全的肝素类药物。(4)硫酸乙酰肝素位于宿主细胞表面,在病毒和宿主细胞相互作用中发挥重要作用。我们以近年来引发全球疫情的猴痘病毒和新冠病毒为例,研究了糖胺聚糖在病毒入侵中的重要作用。第一个案例是猴痘病毒与糖胺聚糖的相互作用。我们通过表面等离子共振技术,证明了猴痘病毒A29蛋白,可与包括肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素在内的糖胺聚糖结合,且糖胺聚糖上的负电荷对于结合至关重要。我们还发现,糖胺聚糖的类似物,即戊聚糖多硫酸盐和粘多糖多硫酸盐,可以强烈抑制猴痘病毒A29蛋白与肝素的结合。另一个研究案例是新冠病毒与糖胺聚糖的相互作用。我们介绍了奥密克戎毒株的系统发育树,以及BA.2.12.1、BA.4和BA.5的刺突糖蛋白受体结合域的氨基酸突变,利用表面等离子共振技术发现不同奥密克戎亚谱系倾向于结合不同链长和不同硫酸化模式的肝素糖链。此外,分子对接结果显示了受体结合域中的碱性氨基酸残基和肝素上的硫酸基团和羧基对相互作用的贡献。同样地,我们发现戊聚糖多硫酸盐和粘多糖多硫酸盐对奥密克戎BA.2.12.1、BA.4和BA.Median sternotomy5的刺突糖蛋白受体结合域与肝素结合的抑制作用,表明戊聚糖多硫酸盐和粘多糖多硫酸盐具有良好的抗新冠病毒的能力。综上所述,本论文从典型的案例入手,解决了肝素类多糖与蛋白质相互作用研究中涉及的关键问题,丰富了对糖胺聚糖的结构与功能的认识,对于糖胺聚糖药物的开发具有重要意义。