目的:肝损伤是肝豆状核变性最常见的表现之一,如不能早期有效干预,可进行性发展为肝硬化或暴发性肝衰竭,甚至引起死亡,给家庭和社会带来沉重负担。早期有效干预是治疗本病的重要手段,课题组前期研究证实肝豆扶木汤能有效改善肝豆状核变性肝损伤症状。最近研究表明,铁死亡与肝损伤发病机制密切相关。本研究基于此,围绕明确铁死亡是否参与肝豆状核变性肝损伤的发病机制;明确肝豆扶木汤在体内抑制铁死亡防治肝豆状核变性肝损伤的作用机制;基于SLC7A11/GPX4通路探讨肝豆扶木汤在体外抑制HepG2细胞铁死亡的作用机制开展研究,探讨肝豆扶木汤治疗肝豆状核变性肝损伤的作用机制,为指导临床治疗和新药研发提供科学依据。方法:第一部分SLC7A11/GPX4通路调控铁死亡在肝豆状核变性肝损伤发病中的作用20只TX-j小鼠随机分为模型组、甲磺酸去铁胺(Deferoxamine mesylate,DFO)组、四硫钼酸铵(Tetrathiomolybdate,TM)组、TM+DFO组;25只相同遗传背景的野生型DL小鼠随机分为对照组、高铜组、高铁组、高铜+TM组、高铁+DFO组。其中TM组、DFO组和TM+DFO组:先予普通纯化饲料饲养28d,再分别予腹腔注射TM、DFO和TM+DFO试剂,持续7d;高铜组和高铁组:先分别予喂饲含铜和含铁的标准饲料饲养28d,再予生理盐水进行腹腔注射,持续7d;高铜+TM组:按照高铜组的方法予以高铜饲料饲养28d后,按照TM组的方法予以腹腔注射TM,持续7d;高铁+DFO组:按照高铁组的方法予以高铁饲料饲养28d后,按照DFO组的方法予以腹腔注射DFO,持续7d;模型组和对照组先予普通纯化饲料饲养28d后,再予生理盐水进行腹腔注射,持续7d。检测血清肝纤四项(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ)、肝功能(AST、ALT),肝组织铜、铁离子,GSH、MDA的含量;流式细胞术检测肝组织中ROS以及HE、Masson染色观察肝组织病理学的变化;透射电镜观察肝细胞线粒体结构;Western Blot检测肝组织铁死亡相关蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测肝组织铁死亡相关mRNA表达。第二部分肝豆扶木汤抑制铁死亡预防肝豆状核变性肝损伤的作用40只TX-j小鼠随机分为GDFMD低、中、高剂量组、D-青霉胺(PCA)组和模型组,8只相同遗传背景的野生型DL小鼠作为对照组。根据动物与人体间的等效剂量换算原则,GDFMD低、中、高剂量组分别予以3.48、6.96、13.92g/kg生药灌胃,PCA组需先将青霉胺片研成极细粉末,使用超纯水将其配成混悬液,以体重0.1g/kg青霉胺净药量进行灌胃。以0.2m L/10g小鼠液量灌胃给药,对照组和模型组用等容积的生理盐水灌胃,每天1次,连续灌胃4周。采用ELISA法检测血清肝纤四项(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ);比色法检测血清肝功能(AST、ALT)、肝组织GSH、MDA的含量;流式细胞术检测肝组织中ROS以及HE、Masson染色观察肝组织病理学的变化;透射电镜观察肝细胞中线粒体结构;Western Blot检测肝组织铁死亡相关蛋白表达情况;RT-qPCR检测肝组织铁死亡相关mRNA表达。第三部分基于SLC7A11/GPX4通路探讨肝豆扶木汤体外抑制铁死亡的作用机制构建Erastin诱导HepG2细胞铁死亡的细胞模型,分三个实验进行正、反向验证。正向验证实验分为5组:对照组、模型组,GDFMD低、中、高剂量组。回复实验一分为5组:对照组、模型组、GDFMD组、抑制剂组、抑制剂+GDFMD组。回复实验二分为6组:对照组、模型组、GDFMD组、si-SLC7A11组、si-SLC7A11+GDFMD组、si-NC组。比色法检测细胞GSH、MDA;流式细胞术检测细胞中ROS;透射电镜观察细胞线粒体形态变化;荧光探针检查细胞线粒体脂质过氧化物和线粒体内亚铁离子;免疫荧光和Western Blot检测肝组织铁死亡相关蛋白表达情况;RT-qPCR检测肝组织铁死亡相关mRNA表达。结果:第一部分SLC7A11/GPX4通路调控铁死亡在肝豆状核变性肝损伤发病中的作用1血清肝功能(AST、ALT):(1)与对照组相比,模型组、高铁组、高铜组中AST和ALT均升高(P<0.01);(2)与模型组相比,TM、DFO和TM+DFO组AST、ALT均下降(P<0.05或P<0.01);(3)与高铁组相比,高铁+DFO组中AST下降(P<0.01);(4)与高铜组相比,高铜+TM组中AST、ALT均下降(P<0.05或P<0.01)。2血清肝纤四项(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ):(1)与对照组相比,模型组、高铁组和高铜组HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ均升高(P<0.05或P<0.01);(2)与模型组相比,TM组中HA、LN、C-Ⅳ降低(P<0.05),DFO组和TM+DFO组HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ降低(P<0.05或P<0.01)。3肝组织中Cu~(2+)和Fe~(2+)的含量:(1)与对照组相比,模型组Cu~(2+)、Fe~(2+)均升高(P<0.01),高铁组Fe~(2+)升高(P<0.01),高铜组Cu~(2+)升高(P<0.01);(2)与模型组相比,TM组Cu~(2+)下降(P<0.01),DFO组Fe~(2+)下降(P<0.01),TM+DFO组Cu~(2+)和Fe~(2+)均下降(P<0.01);(3)与高铁组相比,高铁+DFO组Fe~(2+)下降(P<0.01);(4)与高铜组相比,高铜+TM组Cu~(2+)下降(P<0.01)。4肝组织中GSH、MDA、ROS的含量:(1)与对照组相比,模型组、高铁组和高铜组GSH降低、MDA和ROS均升高(P<0.01);(2)与模型组相比,TM组、DFO组和TM+DFO组GSH升高、MDA和ROS均降低(P<0.01);(3)与高铁组相比,高铁+DFO组GSH升高、MDA和ROS均降低(P<0.01);(4)与高铜组相比,高铜+TM组GSH升高、M更多DA和ROS降低(P<0.01)。5肝组织病理形态学(1)HE染色:镜下观察,细胞核呈蓝色,细胞质、间质以及纤维组织呈红色。对照组可见细胞结构正常,细胞大小均一,肝小叶结构完整。与对照组相比,模型组、高铜组、高铁组可见肝细胞变性坏死,大小不一,炎性细胞浸润,肝小叶结构不完整,纤维间隔形成。TM组、DFO组、TM+DFO组、高铜+TM组和高铁+DFO组可见肝细胞变性坏死、炎性细胞浸润、肝小叶的结构有着不同程度的改善。(2)Masson染色:镜下观察,细胞核呈蓝褐色,胞质、肌纤维呈红色,胶原纤维呈蓝色。对照组细胞结构正常、排列有序,偶见少许胶原纤维沉积。与对照组比较,模型组、高铜组、高铁组小鼠肝组织胶原纤维沉积程度升高(P<0.01);与模型组比较,TM、DFO组减轻(P<0.01);与高铁组比较,高铁+DFO组减轻(P<0.01);与高铜组比较,高铜+TM组减轻(P<0.01)。6肝细胞线粒体结构:在透射电镜下发现,与对照组相比,模型组中肝细胞的线粒体破坏、肿胀,嵴断裂、消失;TM组线粒体嵴断裂、消失,线粒体变小;DFO组线粒体嵴结构尚清晰,但线粒体肿胀明显;TM+DFO组线粒体嵴结构尚清晰,线粒体形态不肿胀,数量相对减少。此外,高铜组的肝细胞线粒体的嵴结构尚清晰,线粒体稍有肿胀,高铁组的肝细胞线粒体的嵴结构破坏、消失,线粒体缩小。高铜+TM组肝细线粒体肿胀减轻,高铁+DFO组肝细胞线粒体的嵴结构尚可。7肝组织中SLC7A11/GPX4通路蛋白表达:(1)与对照组相比,模型组和高铁组P53蛋白表达升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达均下降(P<0.01);(2)与模型组相比,DFO组和TM+DFO组P53蛋白表达下降,SLC7A11、GPX4蛋白表达均上升(P<0.05或P<0.01);(3)与高铁组相比,高铁+DFO组P53蛋白表达下降,SLC7A11蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。8肝组织SLC7A11/GPX4通路的mRNA表达:(1)与对照组相比,模型组、高铁组P53 mRNA表达升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.01);(2)与模型组相比,DFO组、TM+DFO组P53 mRNA表达下降,SLC7A11、GPX4 mRNA表达升高(P<0.01);(3)与高铁组相比,高铁+DFO组P53 mRNA表达下降、SLC7A11和GPX4 mRNA表达升高(P<0.01)。第二部分肝豆扶木汤抑制铁死亡预防肝豆状核变性肝损伤的作用1 GDFMD对各组小鼠血清肝功能(AST、ALT)和肝纤四项(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ)水平的影响(1)肝功能(AST、ALT):(1)与对照组相比,模型组AST、ALT均升高(P<0.01);(2)与模型组相比,GDFMD-L、GDFMD-M、GDFMD-H、PCA组中AST、ALT均下降(P<0.01)。(2)肝纤四项(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ):(1)与对照组相比,模型组中HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ均升高(P<0.01);(2)与模型组相比,GDFMD-M、GDFMD-H和PCA组HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ均下降(P<0.05或P<0.01)。2 GDFMD对各组小鼠肝组织中GSH、MDA、ROS水平的影响:(1)与对照组相比,模型组GSH下降、MDA和ROS均升高(P<0.01);(2)与模型组相比,GDFMD-L组中MDA、ROS均下降(P<0.05或P<0.01);GDFMD-M、GDFMD-H、PCA组中GSH升高、MDA和ROS下降(P<0.01)。3.GDFMD对各组小鼠肝组织病理形态学的影响(1)HE染色:镜下观察,细胞核呈蓝色,细胞质、间质以及纤维组织呈红色。对照组细胞结构正常,细胞大小均一,肝小叶结构完整。与对照组相比,模型组组肝细胞变性坏死,大小不一,炎性细胞浸润,肝小叶结构不完整,纤维间隔形成。GDFMD-L、GDFMD-M、GDFMD-H、PCA组可见肝细胞炎性细胞浸润、肝小叶的结构有着不同程度的改善。(2)Masson染色:镜下观察,细胞核呈蓝褐色,胞质、肌纤维呈红色,胶原纤维呈蓝色。对照组细胞结构正常、排列有序,偶见少许胶原纤维沉积。与对照组比较,模型组胶原纤维沉积程度升高(P<0.01);与模型组比较,GDFMD-L、GDFMD-M、GDFMD-H、PCA组减轻(P<0.01)。4 GDFMD对各组小鼠肝细胞线粒体结构的影响:在透射电镜下发现,与对照组相比,模型组中肝细胞的线粒体破坏,线粒体嵴断裂、消失,线粒体肿胀;GDFMD-L、GDFMD-M、GDFMD-H、PCA组肝细胞线粒体嵴断裂、消失的情况出现不同程度的改善。5 GDFMD对各组小鼠肝组织SLC7A11/GPX4通路蛋白表达的影响:(1)与对照组相比,模型组P53蛋白表达上升、SLC7A11和GPX4蛋白表达均下降(P<0.01);(2)与模型组相比,GDFMD-L组中P53蛋白表达下降、GPX4蛋白表达升高(P<0.01),GDFMD-M、GDFMD-H、PCA组中P53蛋白表达下降、SLC7A11和GPX4蛋白表达均上升(P<0.01)。6 GDFMD对各组小鼠肝组织SLC7A11/GPX4通路mRNA表达的影响:(1)与对照组相比,模型组P53 mRNA表达上升、SLC7A11和GPX4 mRNA表达下降(P<0.01);(2)与模型组相比,GDFMD-M组中SLC7A11和GPX4 mRNA表达升高(P<0.01);GDFMD-H、PCA组中P53 mRNA表达下降、SLC7A11和GPX4 mRNA表达上升(P<0.01)。第三部分基于SLC7A11/GPX4通路探讨肝豆扶木汤在体外抑制铁死亡的作用机制1 GDFMD通过调控SLC7A11/GPX4通路对Erastin诱导的HepG2细胞铁死亡的影响(1)GDFMD对Erastin诱导的HepG2细胞GSH、MDA和ROS含量影响:(1)与对照组比较,模型组GSH下降,MDA、ROS升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD-L、GDFMD-M、GDFMD-H组GSH上升,MDA、ROS下降(P<0.01)。(2)GDFMD对Erastin诱导的HepG2细胞P53、SLC7A11和GPX4蛋白表达的影响:(1)与对照组比较,模型组P53蛋白表达上升,SLC7A11和GPX4蛋白表达下降(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD-L组SLC7A11和GPX4蛋白表达上升(P<0.01),GDFMD-M、GDFMD-H组P53蛋白表达下降,SLC7A11和GPX4蛋白表达上升(P<0.01)。(3)GDFMD对Erastin诱导的HepG2细胞P53、SLC7A11和GPX4 mRNA表达的影响:(1)与对照组比较,模型组P53 mRNA表达升高,SLC7A11和GPX4mRNA表达下降(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD-L、GDFMD-M、GDFMD-H组P53 mRNA表达下降,SLC7A11和GPX4 mRNA表达上升(P<0.01)。2 GDFMD通过抵消抑制或沉默SLC7A11表达对Erastin诱导的HepG2细胞铁死亡的影响(1)GDFMD对抑制或沉默SLC7A11表达的HepG2模型细胞GSH、MDA和ROS含量影响回复实验一:(1)与对照组比较,模型组GSH下降,MDA、ROS升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组GSH上升,MDA、ROS下降(P<0.01),抑制剂组GSH下降,MDA、ROS上升(P<0.01);(3)与抑制剂组比较,抑制剂+GDFMD组GSH上升,MDA、ROS下降(P<0.01)。回复实验二:(1)与对照组比较,模型组GSH下降,MDA、ROS升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组GSH上升,MDA、ROS下降(P<0.01),si-SLC7A11组GSH下降,MDA、ROS上升(P<0.01);(3)与si-SLC7A11组比较,si-SLC7A11+GDFMD组GSH上升,MDA、ROS下降(P<0.01)。(2)GDFMD对抑制或沉默SLC7A11表达的HepG2模型细胞线粒体脂质过氧化物影响回复实验一:(1)与对照组比较,模型组的脂质过氧化物升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组下降,抑制剂组升高(P<0.05或P<0.01);(3)与抑制剂组比较,抑制剂+GDFMD组下降(P<0.01)。回复实验二:(1)与对照组比较,模型组脂质过氧化物升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组下降,si-SLC7A11组升高(P<0.05或P<0.01);(3)与si-SLC7A11组比较,si-SLC7A11+GDFMD组下降(P<0.01)。(3)GDFMD对抑制或沉默SLC7A11表达的HepG2模型细胞线粒体形态变化的影响回复实验一:(1)与对照组比较,模型组线粒体的嵴断裂、消失;(2)与模型组比较,GDFMD组线粒体嵴有所改善,抑制剂组细胞线粒体破坏更严重,嵴消失;(3)与抑制剂组比较,抑制剂+GDFMD组线粒体嵴有所改善。回复实验二:(1)与对照组比较,模型组线粒体嵴断裂、消失;(2)与模型组比较,GDFMD胞线粒体嵴有所改善,si-SLC7A11组线粒体的破坏更严重,嵴消失;(3)与si-SLC7A11组比较,si-SLC7A11+GDFMD组线粒体嵴有所改善。(4)GDFMD对抑制或沉默SLC7A11表达的HepG2模型细胞线粒体内亚铁离子的含量影响回复实验一:(1)与对照组比较,模型组细胞线粒体内Fe~(2+)含量升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组下降,抑制剂组升高(P<0.01);(3)与抑制剂组比较,抑制剂+GDFMD组下降(P<0.01)。回复实验二:(1)与对照组比较,模型组细胞线粒体内Fe~(2+)含量升高(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组下降,si-SLC7A11组升高(P<0.01);(3)与si-SLC7A11组比较,si-SLC7A11+GDFMD组下降(P<0.01)。(5)GDFMD对抑制或沉默SLC7A11表达的HepG2模型细胞的P53、SLC7A11和GPX4蛋白表达的影响回复实验一:(1)与对照组比较,模型组P53蛋白表达升高,SLC7A11和GPX4蛋白表达下降(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组P53蛋白表达下降,SLC7A11和GPX4蛋白表达上升(P<0.01),抑制剂组SLC7A11和GPX4蛋白表达下降(P<0.01);(3)与抑制剂组比较,抑制剂+GDFMD组P53蛋白的表达下降,SLC7A11和GPX4蛋白表达升高(P<0.01)。回复实验二:(1)与对照组比较,模型组细胞中P53蛋白表达升高,SLC7A11和GPX4蛋白表达下降(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组P53蛋白表达下降,SLC7A11和GPX4蛋白表达上升(P<0.01),si-SLC7A11组SLC7A11和GPX4蛋白表达下降(P<0.01);(3)与si-SLC7A11组剂组比较,si-SLC7A11+GDFMD组P53蛋白的表达下降,SLC7A11和GPX4蛋白表达升高(P<0.01)。(6)GDFMD对抑制或沉默SLC7A11表达的HepG2模型细胞的P53、SLC7A11和GPX4 mRNA表达的影响回复实验一:(1)与对照组比较,模型组P53 mRMedicaid reimbursementNA表达升高,SLC7A11和GPX4mRNA表达下降(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组P53 mRNA表达下降,SLC7A11和GPX4 mRNA表达上升(P<0.01),抑制剂组SLC7A11和GPX4 mRNA表达下降(P<0.01);(3)与抑制剂组比较,抑制剂+GDFMD组P53 mRNA的表达下降,SLC7A11和GPX4 mRNA表达升高(P<0.05或P<0.01)。回复实验二:(1)与对照组比较,模型组P53 mRNA表达升高,SLC7A11和GPX4mRNA表达下降(P<0.01);(2)与模型组比较,GDFMD组P53 mRNA表达下降,SLC7A11和GPX4 mRNA表达上升(P<0.01),si-SLC7A11组SLC7A11和GPX4mRNA表达下降(P<0.01);(3)与si-SLC7A11组剂组比较,si-SLC7A11+GDFMD组P53 mRNA的表达下降,SLC7A11和GPX4 mRNA表达升高(P<0.01)。结论:WD动物模型TX-j小鼠中存在铁代谢异常,铁死亡参与了WD肝损伤的发病机制;GD点击此处FMD能有效改善WD肝损伤,提高肝组织抗氧化能力,恢复线粒体形态,其机制与上调SLC7A11/GPX4通路表达,抑制肝细胞铁死亡有关。因此,SLC7A11/GPX4通路可能为GDFMD治疗WD肝损伤的新靶点。