最新的全球癌症负担数据显示,结直肠癌已成为全球最为常见的癌症之一,排名第三。在我国,结直肠癌的发病率和死亡率正呈上升趋势,最新的国家癌症中心统计数据表明,它已成为恶性肿瘤中发病率第二高和死亡率第四高的癌症。因此,探索安全、高效的结直肠癌治疗方法具有重大意义。化疗过程中,易产生肿瘤耐药性,而在使用免疫药物时,常出现免疫逃逸和免疫耐受,易造成肿瘤恶性转移。结肠癌作为一种实体瘤血管异常繁杂,血液供氧不足。同时,肿瘤细胞代谢旺盛,进一步加剧缺氧状况。因此,针对肿瘤乏氧以及化疗耐药性,纳米药物递送系统的治疗效果日益显著。目的:1.探讨如何克服结肠中的细胞外基质和粘液的阻碍,以便更多的纳米药物能够富集到结肠癌部位,并且探讨纳米马达跨越肠道屏障的机制。2.探讨如何通过超声驱动纳米马达来促进肿瘤细胞产生铁死亡,从而发挥抗肿瘤免疫效应,并且探讨超声驱动纳米马达产生铁死亡的机制。3.探讨如何通过超声驱动口服纳米马达克服肿瘤乏氧环境,从而增强的超声动力学效应来对抗肿瘤的复发和转移。4.探讨如何通过避免肿瘤免疫治疗中的免疫逃逸和免疫耐受,预防原位结肠癌复发和转移的潜在抗肿瘤免疫机制。方法:1.纳米马达(GNE-140抑制剂CS-ID@NMs)的制备和表征。蚕茧中提取再生丝素蛋白。制备介孔二氧化锰纳米材料Barasertib半抑制浓度。通过溶剂挥发法对介孔二氧化锰进行表面修饰丝素蛋白材料。通过经典的酰胺化反应,在丝素蛋白表面修饰硫酸软骨素分子,以实现对结肠癌的靶向。使用动态光散射技术对CS-ID@NMs的粒径和电位进行分析表征。通过傅里叶红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)和X射线衍射(X-ray Diffraction,XRD)对CS-ID@NMs进行蛋白质二级结构分析。采用传统透析法研究纳米马达的释药响应行为。2.超声驱动CS-ID@NMs的体外抗肿瘤实验。使用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测超声驱动CS-ID@NMs的抗肿瘤活性。研究超声驱动CS-ID@NMs的结肠癌细胞的靶向吞噬和溶酶体逃逸情况。CS-ID@NMs释放声敏剂的线粒体靶向情况。超声驱动CS-ID@NMs对肿瘤细胞的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶4和脂质过氧化(Lipid peroxide,LPO)的含量变化情况。超声驱动CS-ID@NMs的抗肿瘤免疫性能,高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Protein B1,HMGB1)和钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的含量变化。超声驱动靶向纳米马达的肿瘤球渗透性能。3.多功能CS-ID@NMs的生物分布和生物安全性评价。采用动物荧光成像系统拍摄CS-ID@NMs在五脏器官(心、肝、脾、肺和肾)以及胃肠道(胃、十二指肠、空肠、回场、盲肠和结肠)的荧光图像。采用共聚焦显微镜拍摄超声驱动纳米马达在结肠组织的结肠癌靶向吞噬现象。不同剂量的CS-ID@NMs在口服后体重变化和器官指数变化,五脏器官(心、肝、脾、肺和肾)和胃肠道(胃、十二指肠、空肠、回场、盲肠和结肠)的病理切片,以及血常规分析。4.超声驱动CS-ID@NMs对原位结肠癌的抑制以及防止复发和转移。超声驱动CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1(Anti-programmed cell death-Ligand 1)治疗原位结肠癌小鼠。治疗结束后对小鼠结肠肿瘤的大小进行定量分析。收集血清进行炎症因子(Tumor necrosis factorα,TNF-α和Interferonγ,INF-γ)的测量。收集五脏(心、肝、脾、肺和肾)和结肠用于苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,H&E)染色。结肠癌组织进行细胞增殖(Ki67)染色,凋亡(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL)染色和免疫荧光染色(CD4、CD8、Foxp3和Hypoxia indmedicine containersucible factor-1,HIF1-α)。超声驱动CS-ID@NMs对原位结肠癌治疗小鼠的胸腺中树突细胞和脾脏中的免疫细胞的含量(CD4~+T细胞和CD8~+T细胞)以及初始记忆T细胞,前效应T细胞,中心记忆T细胞,效应记忆T细胞的含量。在转移瘤治疗预防过程中,记录肿瘤的体积大小。收集远端肿瘤组织进行H&E染色、细胞增殖(Ki67)染色,凋亡染色和免疫荧光染色(CD4、CD8和Foxp3)。结果:1.通过在介孔二氧化锰表面修饰丝素蛋白和硫酸软骨素,成功地制备出了平均粒径为212.3 nm,表面电位为-27.3 m V的CS-ID@NMs。此外,在模拟结肠液中具有良好的稳定性。在介孔二氧化锰材料的表面修饰过程中,相对游离的丝素蛋白,CS-ID@NMs形成了更多的β折叠结构。通过释药实验的探究,发现穿越型纳米马达具有多种刺激(酸碱度、谷胱甘肽、活性氧和超声)响应性释药特性。2.超声和靶向硫酸软骨素分子修饰均提高了纳米马达被肿瘤细胞的靶向吞噬。CS-ID@NMs释放的声敏剂具有线粒体靶向的性能。超声促进纳米马达的溶酶体逃逸性能。超声驱动CS-ID@NMs增强肿瘤细胞的活性氧含量、GSH的耗竭和GPX4的下调现象。超声驱动CS-ID@NMs促进了HMGB1的释放和CRT的暴露现象。超声促进纳米马达的肿瘤球靶向渗透。3.超声促进纳米马达跨越肠道屏障,并且可以提高纳米马达在结肠癌组织特异性靶向摄取。口服递送纳米马达后,体重和器官指数没有发生异常变化,没有对主要的器官(心,肝,脾,肺,肾)和胃肠道组织(胃,十二指肠,空肠,回肠,盲肠,结肠)造成损伤,没有明显的血液学变化。4.超声驱动CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗抑制原位结肠癌的增殖,而且结肠病理切片的组织学评分最低,凋亡细胞含量最多和增殖细胞最低。并且促进胸腺中树突细胞的成熟最多和促进脾脏中的CD8~+T细胞的增殖和分化最多,CD8效应记忆T细胞的含量最多。同时血清中炎症因子(TNF-α和INF-γ)含量均最多。结肠部位的免疫荧光中发现超声驱动的CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗促进了CD8~+T细胞的增殖和分化最多和免疫抑制细胞最少并且HIF1-α含量最低。超声驱动的CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗有效预防结肠癌的发生和转移。转移瘤免疫荧光切片中,发现超声驱动的CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗促进转移瘤组织的凋亡细胞最多和增殖细胞最低。并且促进了CD8~+T细胞在转移瘤组织中的增殖和分化最多和免疫抑制细胞最少。结论:在本研究中,介孔二氧化锰负载声敏剂,表面经过丝素蛋白和硫酸软骨素的修饰,具有肿瘤微环境多重刺激响应性药物释放(酸碱度、谷胱甘肽、活性氧和超声),从而实现肿瘤部位精确定点可控药物释放。在超声和过氧化氢的双驱动下,CS-ID@NMs可有效跨越肠道屏障,特异性靶向聚集于结肠肿癌细胞。超声驱动CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗可以有效的发挥抗肿瘤免疫治疗模式,并且促进树突细胞的成熟,并且增加CD8~+T细胞的增殖和分化,并且减少调节性T细胞的增殖和分化,促进初始记忆T细胞增殖和分化为前效应T细胞,中心记忆T细胞,最终分化为效应记忆T细胞来是行使抗肿瘤免疫治疗,进而刺激机体产生免疫记忆效应,从而有效抑制原位结肠肿瘤和恶性转移肿瘤。