胆碱作为一种动物生长发育的必需营养素,在预防和治疗奶牛脂肪肝疾病中起重要作用,但其中的调节机制尚不清楚。本研究通过胆碱缺乏培养奶牛肝细胞,然后再补充胆碱,从蛋白质表达、脂质代谢和脂滴融合等方面研究胆碱调节奶牛肝细胞脂滴大小的机制,为阐明胆碱对奶牛脂肪肝的防治机制奠定基础。首先建立奶牛脂肪肝的细胞模型。在培养基中加入0、50、100、150、200、300、400mmol/L浓度的亚油酸处理24 h,通过CCK-8、油红O、尼罗红等方法检测,发现150mmol/L LA显著增加selected prebiotic library了牛肝细胞中TG的积累和脂滴的形成,后续试验选用150mmol/L LA处理牛肝细胞建立脂肪肝的细胞模型。随后通过胆碱缺乏培养基处理肝细胞,油红O染色细胞脂滴,荧光显微镜观察和计算脂滴大小、数量和比值。结果表明,与对照组相比,胆碱缺乏增加了脂滴的平均直径(1.59μm vs 2.10μm),其小脂滴(<2μm)的比例从74%下降到56.6%,大脂滴(>4μm)比例从5.3%增至15%。胆碱缺乏增加了肝细胞中TG含量(0.39μmol/mg vs 0.57μmol/mg)。蛋白分析发现固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、固醇调节元素结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、脂肪酸合成酶(FASN)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)的表达显著上调。采用活细胞工作站观察脂滴融合,发现缺乏胆碱处理后提高了脂滴的融合速度。薄层色谱显示,胆碱缺乏处理后,细胞总磷脂酰胆碱(PC)含量降低。液相色谱-质谱分析表明,胆碱缺乏导致27种磷脂酰乙醇胺(PE)化合物的含量增加,16种PC化合物的含量减少。为了进一步探讨胆碱对脂滴大小影响的作用机制,试验在缺乏胆碱的培养基中添加不同浓度的胆碱,观察对脂滴的影响。用0、30、60、90μmol/L氯化胆碱处理细胞后,发现随着胆碱的加入,脂滴的大小随着浓度的增加而减小,脂滴直径分别为2.37μm、1.54μm、1.43μm、1.39μm,细胞甘油三酯含量也KPT-330抑制剂逐渐下降,分别为0.65μmol/mg、0.45μmol/mg、0.36μmol/mg、0.37μmol/mg,同时细胞中PC的含量则逐渐增加。自噬蛋白检测结果表明,自噬标志物LC3蛋白的表达逐渐增加,而p62蛋白的表达则逐渐减少,表明PI3K抑制剂胆碱可能通过增加自噬水平来调控脂滴的大小。上述结果表明,胆碱缺乏增加了脂滴大小和脂滴融合,并影响了细胞磷脂组成和蛋白质表达。当加入胆碱时,细胞自噬活性逐渐增加,这导致脂滴的表型逆转。这一结果为阐明胆碱缓解围产期奶牛脂肪肝的应用机制提供数据支撑。