骨肉瘤(OS)是儿童和青少年中最常见的原发性骨肿瘤,具有很高的局部浸润和转移倾向,其发病机制与基因、年龄、性别、primary endodontic infection身高、激素等多种因素有关。尽管手术与化疗相结合极大地改善了骨肉瘤患者的预后,但转移性或复发性骨肉瘤的预后仍然不令人满意。因此探究骨肉瘤的发病机制、寻找有效治疗靶点、进行针对性的靶向精准治疗是目前的当务之急。在哺乳动物体内,硫化氢(H_2S)主要通过酶促途径产生,涉及三种酶:胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)以及3-巯基丙酮酸转硫酶(3-MST)。研究表明,H_2S在肿瘤发生发展中具有“双刃剑”作用,这与H_2S的浓度有关。因此,可通过内源性调节H_2S合成酶的表达来改变H_2S的浓度,进而探究H_2S对肿瘤生长的影响情况。虽然H_2S在多种肿瘤中的作用已有大量研究,但H_2S在骨肉瘤细胞中发挥的作用及其机制仍不清楚。本论文旨在探究过表达/敲低CBS基因后对骨肉瘤细胞生长的影响及其作用机制。为了确定H_2S在骨肉瘤细胞中是否发挥作用,首先通过ELISA实验检测了人正常成骨细胞系h FOB1.19和五种骨肉瘤细胞系(143B、SJSA-1、HOS、MG63、U2OS)中的H_2S含量,结果表明,骨肉瘤细胞系尤其是143B和HOS细胞中的H_2S含量显著高于人正常成骨细胞系,据此推测H_2S在骨肉瘤细胞系中可能发挥一定的作用。通过q PCR实验和Western blot实验分别从m RNA水平和蛋白水平检测了三种H_2S合成酶在人正常成骨细胞系和五种骨肉瘤细胞系中的表达情况。结果显示,CBS在五种骨肉瘤细胞系中的m RNA和蛋白水平均高于人正常成骨细胞系,因此,选用CBS表达最高的143B和HOS细胞作为研究对象进行后续研究。为探究CBS在骨肉瘤细胞系中的作用,进行了稳定过表达/敲低CBS的骨肉瘤细胞的构建。将构建好的慢病毒载体感染骨肉瘤143B和HOS细胞,经嘌呤霉素筛选,杀死未感染成功的细胞,利用荧光显微镜观察细胞的荧光效果并通过q PCR实验和Western blot实验检测CBS的表达情况,来验证细胞是否感染成功,确保获得稳定过表达/敲低CBS的骨肉瘤细胞。对成功构建的细胞及正常未感染的细胞进行了如下两大分组:(1)过表达CBS的细胞分组:正常组(Control)、过表达阴性对照组(Mock)以及过表达组(CBS);(2)敲低CBS的细胞分组:正常组(Control)、敲低阴性对照组(sh-Scb)、敲低组(sh-CBS-1和sh-CBS-2)。其中,与Control组相比,Mock组和sh-Scb组的CBS表达无明显差异,CBS组的CBS含量升高,sh-CBS-1组和sh-CBS-2组的CBS水平降低。在体外通过一系列细胞功能实验和分子实验检测内源性H_2S合成酶CBS对骨肉瘤细胞生长的影响及作用机制。MTT实验和CCK-8实验表明过表达CBS促进骨肉瘤细胞存活,敲低CBS抑制细胞存活;Tunel实验检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白和焦亡相关蛋白的表达水平,得知过表达CBS能够抑制骨肉瘤细胞发生凋亡和焦亡,敲低CBS则作用相反。Ed U实验、平板克隆实验和软琼脂集落形成实验证明过表达CBS增强骨肉瘤细胞的增殖能力、克隆形成和集落形成能力Apoptosis抑制剂;敲低CBS则抑制骨肉瘤细胞的增殖、克隆和集落形成。通过划痕实验和Transwell实验、Invasion实验研究了CBS对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响,并通过Western blot检测EMT相关蛋白,得知过表达CBS促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,敲低CBS则发挥抑制作用。本论文也进行了作用机制的探讨,推测mi R-3918靶向CBS可能通过ROS介导的NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞的生长。在体内通过建立骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,采用小动物活体成像技术实时监测各组肿瘤的生长情况。免疫组化染色检测各组肿瘤的Ki67、CD31、Cleaved caspase-3、Cleaved GSDMD、Vimentin、p-p65等Puromycin试剂指标。结果表明,过表达CBS促进肿瘤增殖、血管生成、侵袭,抑制肿瘤死亡,加快肿瘤的生长;敲低CBS则相反。综上所述,体外实验和体内实验共同说明,mi R-3918靶向CBS可能通过ROS介导的NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞的存活、增殖、克隆、集落形成、迁移和侵袭,抑制细胞的死亡,从而发挥促进骨肉瘤细胞生长的作用。