目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,在全世界36种癌症中死亡率居第二位。铁死亡是一种新型的细胞死亡方式,在二价铁或脂氧合酶的作用下,催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸,从而发生脂质过氧化来诱导细胞死亡。既往研究表明,铁死亡过程中脂肪酸代谢发生改变,且这种改变会影响铁死亡进程和细胞命运。在铁死亡与脂肪酸代谢相关的生物进程中,脂氧合酶发挥着重要调控作用。花生四烯酸脂氧合酶-3(Arachidonate lipoxygenase 3,ALOXE3)上调已被证明与多种癌症的发生息息相关,但对其在结直肠癌中表达的生物学功能和潜在机制知之甚少,本研究通过生物信息学大数据分析,旨在探讨ALOXE3基因与结直肠癌免疫微环境及预后的相关性。研究方法:在TCGA数据库和GEO数据库中下载结直肠癌患者的基因表达数据集,并从Gene Cards网站Version 5.8中获得了脂肪酸代谢和铁死亡相关基因的数据集。利用R-studio对下载的数据进行处理并整理相应临床信息,分别提取其中与脂肪酸代谢差异相关基因及与铁死亡相关基因,并筛选出两个基因组中存在的共有差异基因。对这些共同差异基因进行Kaplan-Meier生存分析和ROC分析,从而筛选预后相关的ALOXE3基因。接下来探讨ALOXE3基因在结直肠癌中的表达以及其与临床病理特征之间的关系。使用单因素与多因素独立预后分析,判断ALOXE3是否可作为独立预后因子。通过GO和KEGG分析,探究ALOXE3可能参与的生物过程与信号通路。使用CIBERSORT工具分析ALOXE3与结直肠癌免疫细胞浸润之间的潜在相关性。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)实验分析ALOXE3在结直肠癌组织及细胞的表达水平。结果:1.筛选出CRC样本与正常样本之间具有差异表达的162个脂肪酸代谢相关基因(91个下调脂肪酸代谢基因和71个上调脂肪酸代谢基因),以及115个铁死亡相关基因(42个下调铁死亡基因和73个上调铁死亡基因)。将筛选出来的两个基因组进行比对,得到15种共有差异基因,分别为:ACSF2、SCP2、ACSL4、ALOXE3、GABARAPL1、PRKAA2、ABCC1、PTGS2、GPX2、HSD17B11、GPX4、AKR1C3、SCD、FADS2和PRDX6。2.将上述15个基因分别进行Kaplan-Meier生存分析,结果显示,其中SCP2、GPX4和ALOXE3高表达组患者生存率明显低于低表达组(P<0.05)。通过计算ROC曲线下的面积,得到1年、3年和5年生存率的AUC测量值。SCP2基因的AUC值分别0.426、0.408和0.401。GPX4基因的AUC值分别为0.527、0.565和0.642。ALOXE3基因的AUC值分别为0.682、0.622和0.629。上述结果表明在SCP2、GPX4和ALOXE3中,仅ALOXE3对生存结果的预测准确性较好。3.通过对结直肠癌与癌旁组织的差异分析发现,ALOXE3在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达具有显著性差异(P<0.001),与癌旁组织相比,ALOXE3基因的表达水平在结直肠癌组织中显著上调。配对差异分析表明ALOXE3基因在同一个病人的结直肠癌组织与癌旁组织之间存在显著性差异(P<0.001),且与癌旁组织相比,ALOXE3基因的表达水平在结直肠癌组织中显著上调。4.单因素独立预后分析结果表明,ALOXE3(P=0.004)、Stage(P<0.001)与结直肠癌患者预后相关。多因素回归分析结果表明,ALOXE3(P=0.011)、Stage(P<0.001)。该基因在单因素Cox回归分析及多因素Cox回归分析中均满足P<0.05被认为是独立预后因素。通过分析ALOXE3基因高低表达组患者的无进展生存期,结果具有显著差异(P=0.002),随着时间延长,高低表达组数据差异越大。高表达组无进展生存期与低表达组相比明显缩短。5.对ALOXE3进行GO与KEGG功能富集分析发现,该基因主要富集在“表皮细胞的分化”、“信号受体激活活性”、“通路活动”、“被动跨膜转运蛋白活性”“IL-17信号通路”等。这些生物学功能与通路与癌症的形成、生长和转移相关。6.Trichostatin A使用CIBERSORT工具分析高低风险组结直肠癌患者的免疫细胞浸润差异,结果表明,高低风险组在静息的CD4记忆T细胞(P<0.05)、滤泡辅助性T细胞(P<0.05)、活化的自然杀伤细胞(P<0.05)、中性粒细胞(P<0.01)中免疫浸润程度具有差异性。其中静息的CD4记忆T细胞在低风险组免疫浸润程度较高。活化的自然杀伤细胞、中性粒细胞、滤泡辅助性T细胞在高风险组免疫浸润程度较高。通过免疫检查点的相关性分析,观察到免疫检查点immune imbalance相关的基因如VTCN1、CD86、IDO1、HAVCR2等与ALOXE3之间都是正调控关系。通过肿瘤微环境差异分析发现,免疫细胞打分在ALOXE3基因的高表达组中是升高的,说明ALOXE3基因的表达越高,免疫细胞的含量也越高。7.RT-q PCR结果显示,ALOXE3在结直肠癌组织及细胞中均明显高表达且与正常组织相比,均具有显著性差异(P<0.01),与生物信息学分析结果一致。结论:1.通过筛选脂肪酸代谢及铁死亡相关基因并进行生存分析和ROC分析从而得到ALOXE3基因,且验证该基因在结直肠癌组织中显著高表达;2.ALOXE3基因与结直肠癌患者的不良预后相关,且可能影响免疫细胞浸润水平,并通过抑制抗肿瘤免疫反更多应影响肿瘤发生发展。