研究目的:非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种由多种因素引起的临床病理综合征,与人们的生活方式和饮食习惯息息相关,其病程包括单纯性肝脂肪变性(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏纤维化和肝硬化。预计NAFLD的发病率在未来将持续增加,且呈现低龄化趋势。”二次打击”假说认为NAFLD发展的病理机制主要归因于脂质代谢紊乱、氧化应激和细胞凋亡。肝脏的氧化应激反应影响肝细胞的正常功能,当活性氧的产生超过了抗氧化能力时,这些分子就会引起正常脂质代谢紊乱。虽然NAFLD的病理作用已被广泛研究,但其分子机制尚不清楚。目前,学者致力于运动干预NAFLD的研究,发现运动可诱导相关蛋白因子的表达,从而达到防治非酒精性脂肪肝的效果。美国肝病研究协会建议将体育锻炼作为治疗NAFLD的一种方法。因此,本文采用自主跑轮运动干预方式探究运动对NAFLD小鼠诱发进程中自主跑轮运动对小鼠肝脏脂质沉积、氧化应激水平、线粒体功能和细胞凋亡的作用机制,为运动干预NAFLD提供理论依据。研究方法:60CL13900浓度只8周龄雄性C57BL/6J (实验动物质量许可证号:SYXK(苏)2018-0027),购自江苏集萃药康科技有限公司,饲养在江苏农业科学院实验动物中心。小鼠一鼠一笼,参照国家啮齿类动物干饲料标准喂养饲料,自由进食、饮水,饲养环境在12/12h光/暗循环且通风良好光照自然条件下,室温在22±2℃,相对湿度在40%-58%,1-2天更换一次小鼠垫料。适应性饲养1周后随机分为两组,分别用普通膳食(normal diet,ND)和高脂肪、果糖和胆固醇膳食(High-fat,fructose and cholesterol,HFFC)饲养,HFFC膳食小鼠在饲养6周和10周后,各分出10只进行自主跑轮运动干预,其余在安静状态下继续进行HFFC膳食饲养。运动组小鼠每天在装有自主跑轮的笼中自由活动,利用磁感应累加计数器记录小鼠跑轮圈数,固定传感器于跑轮顶端,磁铁片装载于转轮顶端,当转轮旋转一圈后与传感器重合即累计1圈,计数频率可达10次/秒。隔日进行跑轮圈数的记录与清零,连续8周。饲养周期14周小鼠分为ND14组、HFFC14组和HFFC6+E8组,同样饲养周期18周小鼠分为ND18组、HFFC18组和HFFC10+E8组,每组各10只。末次训练结束后,恢复24小时测量体重并处死小鼠,取新鲜肝脏组织通过梯度离心法提取肝脏线粒体检测线粒体功能,液相氧电极检测线粒体呼吸控制率(respiratory control rate,RCR),活性氧检测试剂盒检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,利用JC-1探针通过流式细胞分析检测线粒体GW-572016细胞培养膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)等;取肝脏样本检测总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物歧化酶(SOD)和抗氧化物丙二醛(MDA)含量;免疫蛋白印迹法测定核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、一氧化氮岐化酶(SOD1)、血红素氧合酶1(HO-1)、BCL-2相关蛋白X/B淋巴细胞瘤-2(Bax/Bcl2)等氧化应激及凋亡相关蛋白表达量水平和线粒体热休克蛋白70(mtHSP70)、线粒体热休克蛋白60(mtHSP60)、酪蛋白水解肽酶(ClpP)等线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt)相关分子伴侣蛋白和蛋白酶的表达。数据用SPSS统计软件22.0进行统计分析。氧电极(Hansatech)检测肝脏线粒体呼吸控制率,O2view系统收集数据。流式细胞用流式细胞仪(ACEA Novo CyteTM)检测荧光强度,Novo Express TM软件进行分析。Western blotting结果采用Bio-Rad多色凝胶成像系统,图像分析软件Image Lab Software5.2分析,数据均用GraphPad Prism 8.0.2软件作图,各组间比较采用单因素方差分析,显著性水平选择P<0.05和P<0.01。研究结果:1)与普通膳食小鼠相比,14和18周HFFC膳食小鼠的体重和肝脏重量及肝指数均显著增加(P<0.05),且18周HFFC膳食小鼠的肝脏重量和肝指数较14周显著增高(Pstent graft infection<0.01);运动干预后,与HFFC18相比,HFFC10+E8组体重及肝指数显著降低(P<0.01);2)HFFC14组小鼠T-AOC、CAT和SOD的活性显著低于ND14组(P<0.05),过氧化物MDA含量显著升高(P<0.01),且HFFC18组小鼠肝脏T-AOC水平较HFFC14组显著降低(P<0.05),8周自主跑轮运动干预后SOD活性显著升高(P<0.01);与18周普通膳食小鼠相比,高脂肪、果糖和胆固醇膳食小鼠Nrf2和SOD1的蛋白表达水平均显著下降(P<0.05),而HO-1和Bax/Bcl2表达量显著增加(P<0.05),且HFFC18组较HFFC14组显著增加(P<0.05)。8周自主跑轮运动干预后,HO-1表达量显著增加(P<0.05),Bax/Bcl2显著下降(P<0.01);3)与ND18组相比,HFFC18组小鼠肝脏线粒体含量、RCR水平和高膜电位/低膜电位比例均显著降低(P<0.01),ROS水平显著升高(P<0.05),且较HFFC14组,HFFC18线粒体含量和RCR水平显著降低(P<0.01)、ROS水平显著升高(P<0.05),8周运动干预后小鼠肝脏线粒体含量和RCR水平较HFFC18组显著增多,ROS水平显著降低(P<0.01);4)与ND18相比,18周HFFC膳食组小鼠UPRmt蛋白mtHSP70、mtHSP60和ClpP表达量显著减少(P<0.05),且HFFC18组小鼠mtHSP70、mtHSP60和ClpP蛋白表达水平显著低于HFFC14组小鼠(P<0.05)。18周HFFC膳食小鼠经运动干预后,HFFC10+E8组小鼠mtHSP70和mtHSP60表达量显著增加(P<0.01)。研究结论:1)14周HFFC膳食使小鼠肝脏氧化应激水平增高,同时诱发mtUPR,而18周HFFC膳食导致小鼠肝脏抗氧化系统功能失调、肝损伤加重,线粒体功能受损,mtUPR作用被抑制;2)8周运动干预可显著改善18周HFFC膳食引起的肝脏损伤,上调肝脏抗氧化酶活性及相关基因表达量,提高线粒体功能,并促进mtUPR相关分子伴侣蛋白和线粒体蛋白酶表达,是防治NAFLD发展的有效干预措施。