目的:构建自然选择的CD7 CAR-T并探究自然选择的CD7 CAR-T在体外和体内实验中的作用机制和抗白血病效果。方法:1.利用流式细胞术和免疫组织化学分析CD7在R/R-AML病人和健康供者的正常细胞群中的表达比例,以及R/R-AML病人微小残留病(M RD)中的表达比例。2.体外构建慢病毒载体,装载设计好的CD7 CAR结构。3.利用Ficoll分离液,分离来自健康供者外周血的PBMCs细胞,随后CD3磁珠用于分选CD3~+T细胞。4.CD3~+T细胞复苏,并培养2d,转染转载CD7 CAR结构的慢病毒,并持续培养12天。5.流式细胞术分析转染率,CD7 CAR-T细胞群中CD7表达率,CD7 CAR-T记忆表型,衰竭标志物。6.流式细胞术分析CD7 CAR-T细胞对CD7~+急性髓系白血病细胞系的杀伤效果和对CD7~+R/R-AML原代细胞的杀伤试验,对KG-1a细胞因子释放试验。7.构建CD7~+急性髓系白血病小鼠模型,小动物活体实验追踪小鼠体内肿瘤动力学。结果:1.免疫组织化学提示3例R/R-AML患者骨髓组织中CD117,CD34,MPO高表达,CD7呈现不同程度的表达。流式细胞术分析正常T细胞亚群中CD7比例,健康供者组(HD组)(91.00%-92.10%),R/R-AML组(91.70%-94.00%);正常B细胞亚群中CD7的比例,HD组(0.58%-1.42%),R.R-AML组(1.20%-3.24%);正常单核细胞亚群中CD7比例,HD组(0.21%-2.19%),R/R-AML组(1.51%-3.08%);正常中性粒细胞亚群中CD7比例,HD组(0.34%-0.46%),R/R-AML组(0.31%-0.87%)。利用流式细胞术分析AML患者微小残留病(MRD)中CD7比例,统计了16例AML-MRD阳性患者,其中MRD中CD7阳性的5例,并呈现不同水平的表达(78.89%,31.38%,79.96%,60.75%,5.11%)。2.我们体外构建了自然选择CD7 CAR结构,并在转染后day0、day7、day10、day12测定扩增倍率:day0(NTR:1.00,CD7 CAR:1.00),day7(NTR:3.38-9.00,CD7 CAR:2.80-4.67),day10(NTR:19.35-34.00,CD7 C AR:6.00-16.25),day12(NTR:108.00-158.06,CD7 CAR:18.27-36.25)。3.台盼蓝染色,分别在转染后day7和day12分析细胞活率,day7(N TR:87.20%-91.40%,CD7 CAR:78.3%-81.80%),day12(NTR:90.30%-92.50%,CD7 CAR:80.70%-85.40%)。4.流式细胞术在转染后day4和day12测定转染率和CD7表达率,结果:day4转染率(NTR:0.03%-0.37%,CD7 CAR:83.60%-93.70%),day4 CD7表达(NTR:95.20%-98.90%,CD7 CAR:0.01%-5.08%),day12转染率(NT R:0.11%-0.38%,CD7 CAR:90.80%-94.00%),day12 CD7表达(NTR:91.50%-94.50%,CD7 CAR:0.05%-2.73%)。5.在转染后第12天,细胞孵育CD3-APC-cy7,CD45RO-Percp,CC R7-PE,CD4-PE-cy7,CD8-PB并用流式细胞仪分别对CD4~+和CD8~+细胞亚群测定记忆表型。结果:CD4~+T_(EM)(CD45RO~+CCR7~-)(NTR vs CD7 C AR=23.00%-56.10%vs 32.60%-55.90%),CD8~+T_(EM)(NTR vs CD7 CAR=11.70-31.60%vs 38.00-41.80%);CD4~+T_(CM)(CD45RO~+CCR7~+)(NTR vs CD7 C AR=16.30%-32.40%vs 34.70%-45.40%),CD8~+T_(CM)(NTR vs CD7 CAR=7.92%-28.00%vs 44.90%-51.90%);CD4~+T_(EFF)(CD45RO~-CCR7~-)(NTR vs CD7 CAR=9.63-10.60%vs 7.32%-15.00%),CD8~+T_(EFF)(NTR vs CD7 CAR=14.60-32.00%vs 5.48-9.32%);CD4~+T_N(CD45RO~-CCR7~+)(NTR vs CD7 CAR=3.87-35.00%vs 2.17%-6.95%),CD8~+T_N(NTR vs CD7 CAR=17.30-65.80%vs3.92%-4.95%)。6.转染后第12天,流式细胞仪测定耗竭标志物(PD-1,TIM-3,LAG-3)表达水平,结果:PD-1(NTR vs CD7 CAR=0.05-0.65%vs 0.49-0.64%);TIM-3(NTR vs CD7 CAR=6.45-26.60%vs 40.70-85.00%);LAG-3(NTR vs CD7 CAR=0.02-67.30%-27.10-31.90%)。7.测定CD7 CAR-T的体外杀伤能力,分别对CD7~+急性T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM,CD7~+急性髓系白血病细胞株KG-1a等,CD7~-慢性髓系白血病细胞株K562和通过慢病毒过表达CD7的K562-CD7细胞株,以及R/R-AML的原代细胞共培养,并通过流式细胞仪测定CD7~+肿瘤细胞消除比例。结果:CCRF-CEM,1:1(NTR vs CD7 CAR=4.00-5.10%vs 79.70-https://www.selleck.cn/products/Docetaxel(Taxotere).html90.40%),2:1(4.40%-7.40%vs 88.90%-95.21);4:1(5.20-9.90%vs 92.69-98.53%);KG-1a,1:1(NTR vs CD7 CAR=3.40-6.70%vs 78.90-96.55%),2:1(3.60-8.40%vs 76.60-98.98%),4:1(2.00-7.40%vs 82.80-99.34%);MOLM-13,0.5:1(NTR vs CD7 CAR=4.50-15.30%vs 63.80-92.71%),1:1(5.70-17.20%vs 81.50-96.31%),2:1(6.70%-21.20%vs 91.85-97.43%);K562-CD7 1:1(NTR vs CD7 CAR=9.60-12.20%vs 31.80-64.50%),2:1(12.80-19.70%vs 55.00-90.00%),4:1(12.60-16.00%-78.00-98.49);K562 1:1(NTR v s CD7 CAR=11.50-12.20%vs 11.20-14.90%),2:1(12.54-12.80%vs 12.40-14.90%),4:1(11.20-14.60 vs 12.10-15.00%)。CD7~+R/R-AML原代细胞的剩余百分比,R/R-AML#1 1:1(NTR vs CD7 CAR=17.20%vs 6.16%),2:1(17.40%vs 4.55%),4:1(15.70%vs 2.50%);R/R-AML#2 1:Transperineal prostate biopsy1(38.80%vs 7.61%),2:1(41.00%vs 6.87%),4:1(43.00%vs 5.77%);R/R-AML#3 1:1(46.20%vs 4.89%),2:1(42.30%vs 3.75%),4:1(47.50%vs 3.44%)8.多因子检测试剂盒检测IFN-γ,TNF-α,IL-2,结果:IFN-γ(NTR vs CD7 CAR=7.76-61.62 vs 22063.36-40384.71),TNF-α(5.22-7.93 vs 2415.29-8666.77),IL-2(3.49-24.48 vs 3745.65-6981.68)。9.我们对CD7 CAR在体内抗白血病效能进行验证,并利用IVIS ima ging system,追踪CD7~+白血病细胞在异种移植模型中的肿瘤动力学效应,并对发光定量,Day0:溶媒组vs NTR组vs CD7 CAR组(7.26E4-6.69E5 vs 7.26E4-6.99E5 vs 7.96E4-7.49E5);Day7:溶媒组vs NTR组vs CD7 CAR组(7.99E4-7.03E5 vs 6.71E4-9.79ETezacaftor小鼠5 vs 0-2.65E5);Day15:4.56E6-1.46E7 vs 6.11E6-9.69E6 vs 6.43E4-2.07E5;Day22:1.55E7-2.03E7 vs 1.43E7-2.89E7 vs 0;Day34:3.18E7-6.23E7 vs 3.22E7-8.41E7 vs 0;Day34:3.18E7-6.23E7 vs 3.22E7-8.41E7 vs 0。结论:1.CD7在复发难治AML患者白血病细胞中有不同程度的表达。2.无论是健康供者还是复发难治AML患者,中性粒细胞,单核细胞和B细胞中不表达CD7,T细胞中CD7高表达,这避免了髓系造血系统毒性。3.CD7 CAR在体外培养后,具备高转染率,同时CD7表达阴性,并且以记忆表型为主,衰竭标志物表达低,体外功能试验中,CD7 CAR具备很强的抗白血病效果。4.急性髓系白血病异种移植模型小鼠中,对小鼠体内肿瘤动力学追踪提示CD7 CAR-T强大的抗白血病效果同时在试验期间未观察到小鼠C D7 CAR组小鼠出现明显不良反应。