花青素苷是草莓果实重要的营养物质,对果实色泽的形成至关重要。在我国,草莓主要在冬春季进行设施栽培,设施内光照不足导致草莓果实着色不良,商品性较低。因此,深入解析草莓果实发育与成熟过程中花青素苷代谢的调控机制对草莓果实品质形成至关重要。本研究新发现了两个WRKY转录因子—Fa WRKY44和Fa WRKY46,其均能影响草莓果实中花青素苷的积累,但其中的调控机制还不明确。因此,本研究采用生物信息学、qRT-PCR、过表达或沉默、转录组学和代谢组学、DAP-seq、酵母单/双杂交等技术手段探讨了Fa WRKY44和Fa WRKY46的表达特性及其调控草莓花青素苷代谢的机制。主要的研究内容和结果如下:1.采用PCR方法从两种二倍体野生草莓‘Ruegen’和‘五叶草莓’,两种八倍体栽培草莓‘红颜’和‘丰香’中分别扩增了Fa WRKY44和Fa WRKY46及其同源基因的CDS序列,结果显示WRKY44和WRKY46的CDS或氨基酸序列在这4种草莓中均相对保守。将Fa WRKY44或Fa WRKY46在烟草叶片中进行亚细胞定位,结果显示其蛋白均定位在细胞核中。将Fa WRKY44或Fa WRKY46连接在p ET-32a(+)或p GEX-4T-1原核表达载体上,使用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均能够诱导出可溶diABZI STING agonist浓度的目的蛋白。采用PCR方法从‘红颜’中扩增了Fa WRKY44和Fa WRKY46的启动子,序列分析显示Fa WRKY44的启动子序列(2131 bp)与森林草莓比较接近;Fa WRKY46存在两种启动子序列,其中promoter 1(2419 bp)与森林草莓中的更接近,promoter 2缺失了一段约700 bp的序列。2.采用qRT-PCR方法分析了Fa WRKY46和Fa WRKY44的组织特异性和在不同处理条件(低钾、干旱、低磷、ABA、高盐、低温和红蓝光)下的表达特性。结果表明,Fa WRKY46在‘红颜’草莓的根、茎、匍匐茎、幼叶、功能叶、花和不同发育时期的果实中呈现出强烈的组成型表达趋势,且表达水平极高;Fa WRKY44表现出比较弱的组成型表达趋势,在功能叶和花中相对较高,而在全红的果实中表达水平略低一些。Fa WRKY46对低磷、低温和高盐胁迫相对更敏感,Fa WRKY44则对低钾和低温更敏感。Fa WRKY46和Fa WRKY44均无法快速响应红光或蓝光处理。3.采用VIGS或瞬时过表达方法来改变Fa WRKY46或Fa WRKY44的表达水平。结果显示,在‘红颜’草莓果实中沉默Fa WRKY46或Fa WRKY44均能够抑制果肉中花青素苷的积累,在‘小白’草莓中过表达Fa WRKY46恢复了果肉中花青素苷的积累,但过表达Fa WRKY44则不能。采用qRT-PCR和RNA-seq方法进行了进一步分析,结果发现Fa WRKY46或Fa WRKY44对草莓果实花青素苷代谢的调控更有可能是通过影响花青素苷的转运、储存或降解(稳定性)等后期过程来实现的,而对花青素前期的合成及相关结构基因的影响有限。将Fa WRKY44在拟南芥中过表达后发现,其能够增加拟南芥野生型或3个ttg2突变体(CS2106724、SALK＿204777C、SALK＿206852C)的种子中原花青素的积累。4.采用qRT-PCR、HPLC、转录组学、靶向/类靶向代谢组学、DAP-seq等方法分析了调控‘红颜’和‘小白’草莓果肉的关键基因。结果表明,Fa MYB10或Fa TT19不是引起‘小白’草莓果肉中色素缺失的关键因素。苯丙烷生物合成途径中的Fa C4H对控制草莓果肉着色至关重要,其转录水平受抑制导致了‘小白’草莓果肉中无法积累花青素苷,且这种抑制不是由启动子序列甲基化引起的。Fa WRKY46通过调节Fa C4H的转录以及下游靶基因UFGT7、H~+-ATPase等来影响花青素苷的积累。5.采用酵母单杂交、酵母双杂交、Bi FC和生物信息学预测等方法筛选Fa WRKY44或Fa WRKY46的互作蛋白和上游调控基因。结果表明,Fa WRKY44Ascorbic acid biosynthesis与MBW复合体成员Fa TTG1、Fa EGL3或Fa LWD1-like之间存在蛋白互作,与Fa MYB1或Fa MYB10之间无互作。Fa WRKY46与Fa LWD1、Fa LWD1-like、Fa EGL3、Fa MYB9、Fa MYB10或Fa MYB11之间存在互作,与Fa MYB1、Fa MYB5之间无互作。此外,Fa WRKY44与PR1A、U-box 19、GL2、TT1、MYB59或ABC转运蛋白可能存在互作关系;Fa WRKY46与Nuclear transport factor 2、Dp-1转录因子、PP2C37、MAP3K1、PP2C23、PP2C4、ERF4、b HLH92、MYB39或ABI4等可能存在蛋白互作。Fa WRKY46的启动子能够被MYC2、b HLH13、NAC18、Zinc finger protein 1、WRKY3和FK506-binding protein 4-like结合。6.采用qRT-PCR和瞬时过表达等方法分析了MYBs、MAPKs和ABA信号通路基因对Fa WRKY44或Fa WRKY46转录水平的获悉更多影响。结果显示,草莓果肉中Fa WRKY44或Fa WRKY46的表达水平相对于果皮更容易受到Fa MYB5或Fa MYB10的调控。磷酸激酶Fa MAPK3、Fa MAPK4-2或Fa MAPK16能够影响草莓果肉中Fa WRKY44或Fa WRKY46的表达水平。ABA信号通路中的Fa NCED1、Fa Sn RK2.2或Fa Sn RK2.6对草莓果肉中Fa WRKY46的表达有促进作用,但对果肉中Fa WRKY44的转录则无明显影响。采用酵母双杂交和改进的双荧光素酶方法分析了Fa BT2蛋白对Fa WRKY44或Fa WRKY46蛋白水平的影响。结果表明,Fa BT2与Fa WRKY46或Fa WRKY44蛋白之间均无互作,但Fa BT2蛋白能够强烈的诱导Fa WRKY46蛋白的降解。