目的:通过毒理学实验方法,探讨六味安消散的中毒剂量、毒性靶器官及机制,采用药代动力学计算蒙药六味安消散动力学参数,测定六味安消散毒性成分含量,为六味安消散临床安全合理应用提供科学依据。方MDV3100法:本研究采用拆方方法,分为单味大黄、去大黄方和去诃子方及六味安消散为示列药物,以大鼠为研究对象,评价六味安消散亚急性毒性及毒性机制、分析大黄素体内动力学特征,测定四种毒性成分含量。1.六味安消散亚急性毒性实验:以大鼠为研究对象,分为六味安消散高剂量组(AG)、六味安消散中剂量组(AZ)、六味安消散低剂量组(AD)、大黄高剂量组(DG)、大黄中剂量组(DZ)、大黄低剂量组(DD)、去大黄组(QD)、去诃子组(Qh)正常组(Z)等9组。正常组以外给药组每日灌胃一次相应的药物溶液,连续给予28d,检测血清肝、肾功能相关指标;计算肝和肾脏器指数;进行肝肾组织病理组织学检查。评价六味安消散中毒剂量、中毒靶器官。2.基于肠道菌群16S测序六味安消散亚急性毒性机理初探:结合生物信息学分析及统计方法,对各组内菌群物种组成组件物种功能进行分析,筛选门、刚、目、科、属、种水平,初步明确六味安消散毒性相关的差异菌群及差异通路。3.六味安消散药代动力学实验:以大鼠为研究对象,实验前禁食12 h,灌胃六味安消散后,以10%水合氯醛麻醉大鼠,分别在灌胃后0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、12、24h从眼眶采集血样,应用UPLC-MS法进行血清大黄素的含量测定,计算动力学参数,初步评价吸收、分布、代谢及排泄规律。4.六味安消散毒性成分含量测定:测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚含量,色谱柱为ZORBAX SB-C_(18)(46×250mm,5um),流动相甲醇-0.1%磷酸溶液(70:30),检测波长为254nm,流速为1m L/min,柱温25℃。结果:1.亚急性毒性实验结果显示:(1)对肝肾功能指标的影响:与正常组比较,六味安消散高、六味安消散低、大黄中、大黄低、缺诃子、缺大黄组ALT含量明显升高(p<0.05,p<0.01);六味安消散高、大黄高、缺诃子、缺大黄组AST2.含量明显升高(p<0.05,p<0.01);六味安消散高、大黄高、大黄pathological biomarkers中、缺诃子、缺大黄组UREAL含量升高(p<0.05,p<0.01);大黄高、缺诃子、缺大黄组CREP含量升高(p<0.05,p<0.01)。(2)对脏器指数影响:与正常组比较,大黄高剂量、缺诃子和缺大黄组大鼠的组肝脏指数明显降低(p<0.05,);六味安消散高剂量、大黄高剂量和缺诃子组的肾脏指数明显升高(p<0.05,p<0.01)。由此可见,六味安消散对大鼠肝和肾均具有一定性毒性。(3)对肝肾病理组织学变化的观察:(1)六味安消散组:肝组织结构中度异常,部分肝细胞水肿,胞质淡染,部分肝细胞脂肪变性,胞质可见少量空泡,视野内少量肝细胞水肿,细肝实质内可见少量炎症细胞浸润。肾组织结构中度异常,视野内部分肾小球分叶且萎缩,系膜细寻找更多胞数量减少,部分肾小管呈细胞管型,管腔内可见少量细胞,部分肾小管刷状缘损伤,部分肾小管上皮细胞水肿,细胞肿胀,胞质淡染,组织未见明显炎症细胞浸润。(2)大黄组:肝组织结构中度异常,视野内部分肝细胞水肿,细胞肿胀,胞质淡染,胞质可见少量空泡,未见扩张,肝索排列整齐紧密;肝实质内可见少量炎症细胞浸润。肾组织结构中度异常,视野内部分肾小球萎缩,系膜细胞数量减少,部分肾小球分叶,部分肾小管呈细胞管型,管腔内可见少量细胞,组织未见明显炎症细胞浸润。(3)缺诃子组:肝组织结构中度异常,视野内肝细胞结构完整,胞核圆润,胞质丰富,未见坏死、变性;肝窦大小均匀,未见扩张,肝索排列整齐紧密;肝实质内可见少量炎症细胞浸润。肾组织结构中度异常,大量肾小管呈细胞管型,管腔内可见少量细胞,部分肾小管刷状缘损伤,部分肾小管上皮细胞水肿,细胞肿胀,组织未见明显炎症细胞浸润。(4)缺大黄组:肝组织结构轻度异常,视野内肝细胞结构完整,胞核圆润,胞质丰富,未见坏死、变性;肝窦大小均匀,未见扩张,肝索排列整齐紧密。肾组织结构轻度异常,视野内部分肾小球分叶,膜细胞数量正常,部分肾小管呈细胞管型,管腔内可见少量细胞,组织未见明显炎症细胞浸润。2.六味安消散的亚急性毒性机理分析实验结果显示:正常组有31个差异菌群,Qh组有31个差异菌群,QD组有29个差异菌群,DG组有24个差异菌群。主要普雷沃菌、螺杆菌、梭菌、乳杆菌、丹毒丝菌、双歧杆菌、弯曲杆菌、脱硫弧菌等影响Fox O signaling pathway通路。3.药代动力学实验结果显示:大黄素半衰期(t_(1/2))为7.015±2.730h,经1.017±0.014h后达血浆中浓度最高点,峰浓度(Cmax)为1.2450±0.04087μg/L,随后浓度快速下降,体内待留时间9.256±2.368h,血药浓度曲线下面积(AUC)为7.048±1.034μg/L*h。4.含量测定实验结果显示:六味安消散平均回收率98.39%、98.84%、101.48%、96.38%,大黄平均回收率为96.67%、99.41%、99.03%、97.37%。六味安消散中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚含量分别为0.90mg/g、1.79mg/g、0.70mg/g、0.34mg/g,大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚含量分别为4.58mg/g、7.79mg/g、3.12mg/g、1.56mg/g。结论:1.六味安消散在临床等效量下无亚急性毒性,给药剂量超过临床等效量4倍可产生肝和肾脏亚急性毒性。六味安消散亚急性毒性特征与大黄相似。提示,六味安消散肝肾亚急性毒性主要来自于大黄。2.六味安消散升高大鼠血清中ALT、AST、UREAL、CREP等生化指标与肠道中普雷沃菌、螺杆菌、梭菌、乳杆菌、丹毒丝菌、双歧杆菌、弯曲杆菌、脱硫弧菌紊乱有关。六味安消散肝脏肾脏亚急性毒性肠道菌群变化与大黄相似。3.使用液质联用技术对六味安消散中的毒性成分大黄素进行了药代动力学研究,解释了六味安消散毒性成分在血液中含量规律,为六味安消散中大黄酸、芦荟大黄素及大黄素甲醚等其他毒性成分的动力学分析提供方法学依据。4.六味安消散在2020年版《中国药典》大黄素和大黄酚含量测定基础上建立了利用HPLC法测定六味安消散中主要成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酸和大黄素甲醚含量的方法,为进一步评价六味安消散内在质量控制提供了方法学依据。