目的:非小细胞肺癌发病率高,5年生存率低。肺癌的早期诊断和治疗决定其预后。有研究显示,与p元素诱导的睾丸萎缩(P-element Induced Wimpy Testis,PIWI)蛋白相互作用的核糖核酸(PIWI-interacting RNA,piRNA)对肿瘤发生发展起着重要的调控作用。本研究首先在人血清外泌体中筛选出差异表达的piR-hsa-164586,并进一步探究其对人非小细胞肺癌的诊断价值及相应的调控机制。方法:高通量测序筛选人非小细胞肺癌组织和癌旁组织中差异性表达的piRNAs;实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)检测非小细胞肺癌患者与健康人血清外泌体、非小细胞肺癌细胞与肺正常上皮细胞中piR-hsa-164586的差异性表达,并通过q RT-PCR检测血清外泌体中的piR-hsa-164586在室温环境中的稳定性;低浓度脱氧核糖核苷三磷酸反转录-PCR扩增实验(Reverse Transcription at Low dNTP concentrations followed PCR,RTL-P)检测piR-hsa-164586 3’端存在甲基化的特征;荧光原位杂交(FluorescRAD001采购ence in-situ hybridization,FISH)实验观察piR-hsa-164586的细胞定位;受试者操作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线比较piR-hsa-164586与细胞角蛋白19片段(Cytokeratin-19-fragment,CYFRA21-1)对人早期非小细胞肺癌的诊断效能。分别将piR-hsa-164586过表达和敲低,通过在A549和HCC2279细胞及裸鼠体内验证piR-hsa-164586在非小细胞肺癌中发挥的调控作用;核醣核酸交互作用沉降(RNA pull down)实验获得与piR-hsa-164586结合的蛋白,进行蛋白质谱分析后进一步通过RNA pull down实验和核醣核酸结合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)实验,验证piR-hsa-164586与靶标蛋白的结合关系;最后通过q RT-PCR、蛋白免疫印迹和组织免疫荧光染色实验从m RNA水平和蛋白水平验证piR-hsa-164586对下游靶标蛋白的调控作用。结果:(1)piR-hsa-164586在非小细胞肺癌患者的血清外泌体和肺腺癌细胞A549、肺鳞癌细胞HCC2279中的表达水平显著高于健康人和人正常肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.05),且在核糖核酸酶A非处理组和处理组中无明显统计学差异(P=0.1418),在室温下放置12、24、48小时不同时间段也无明显统计学差异(P=0.3625);RTL-P实验发现piR-hsa-164586在低浓度脱氧核糖核苷三磷酸下无法完成反转录;FISH实验发现,用吲哚三碳菁标记的piR-hsa-164586主要在A549和HCC2279胞核内检测到;(2)ROC曲线结果表明,piR-hsa-164586对人早期非小细胞肺癌的诊断效能高于临床常用的CYFRA21-1,其曲线下面积为0.623(95%置信区间:0.527-0.720),敏感度为0.535,特异性为0.587;(3)Ed U细胞增殖实验结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞增殖活力为49.06%±6.5%,显著高于对照组31.20%±3.19%(P<0.05);在HCC2279细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞增殖活力为60.16%±6.40%,也显著高于对照组35.90%±2.85%(P<0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示,在24、48、72、96h,piR-hsa-164586过表达后A549和HCC2279细胞增殖活力显著增强(P<0.05);流式细胞术结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞凋亡率为6.97%±0.96%,显著低于对照组12.06%±1.41%(P<0.05);在HCC2279细胞中细胞凋亡率为13.77%±0.82%,也显著低于对照组15.66%±0.50%(P<0.05);划痕实验结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞迁移率为44.27%±3.07%,显著高于对照组26.02%±5.55%;在HCC2279细胞中细胞迁移率为50.40%±2.66%,也显著高于对照组33.52%±1.93%(P<0.05)。细胞迁移(Transwell)实验结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞迁移数目是6347±967个,显著多于对照组3331±644个(P<0.05Berzosertib生产商);HCC2279细胞细胞迁移数目是349±57个,显著高于对照组211±35个(P<0.05)。在A549和HCC2279细胞中敲低piR-hsa-164586,上述功能实验则产生了相反的结果(P<0.05)。(4)裸鼠皮下成瘤实验发现,过表达piR-hsa-164586后肿瘤的体积显著增大,重量显著升高;ki67荧光信号为66.80%±8.25%,显著高于对照组20.35%±1.72%(P<0.05);α-SMA阳性率为59.76%±1.99%,显著高于对照组43.97%±5.40%(P<0.05);CD31的阳性个数为44.67±3.68,显著多于对照组34.00±2.45(P<0.05),而敲低piR-hsa-164586则产生相反的结果(P<0.05)。(5)Pulldown和RIP实验结果表明,piR-hsa-164586可以与肌球蛋白重链9(myosin heavy polypeptide 9,MYH9)相互结合,且过表达piR-hsa-164586可以从m RNA和蛋白质水平上调MYH9的表达(P<0.05);(6)Transwell实验显示,敲低MYH9会使A549细胞迁移数目减少,过表达piR-hsa-164586会导致细胞迁移数目显著增加。同时将MYH9和piR-hsa-164586敲低,会使细胞迁移数目进一步减少;敲低MYH9,会显著减少过表达piR-hsa-164586引起的细胞迁移数目(P<0.05)。结论:1.在非小细胞肺癌患者的血清外泌体和细胞中,piR-hsa-164586的表达明显高于健康人的血清外泌体和正常肺上皮细胞。2.piR-hsa-164586可在血清外泌体中稳定存在,对早期非小细胞Anti-biotic prophylaxis肺癌的诊断效能优于临床常用的生物标志物CYFRA21-1。3.过表达piR-hsa-164586在体内外会促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和血管生成能力但抑制凋亡,敲低piR-hsa-164586则会产生相反的作用。4.piR-hsa-164586在非小细胞肺癌细胞内主要通过与MYH9相互作用,促进癌细胞的迁移。