微生物底盘细胞是构建性能优良细胞工厂、实现生物制造产业化的核心。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是非模式天然乙醇生产菌株,因其独特的生理与遗传特性而成为纤维素乙醇及其他生物基平台化合物生产的优良底盘细胞。然而,在纤维素乙醇及其他平台Gefitinib-based PROTAC 3使用方法化合物生产中,在原材料预处理和酶解时会产生抑制物,从而影响发酵过程中Z.mobilis的生长速率和发酵性能,因此其抗逆性与鲁棒性的优化对高效细胞工厂的开发意义重大。前期研究表明过表达全局性调控因子hfq有助于Z.mobilis耐受多种水解抑制物及产物乙醇,但过表达hfq增强乙醇耐受的分子机制尚未阐明。此外,尽管Z.mobilis已经建立了基于内源和外源CRISPR-Cas系统的基因编辑工具,但基因组编辑工具少及编辑效率低等问题制约了底盘细胞重编程优化及应用。本研究以Z.mobilis ZM4为模式,利用系统生物学方法对hfq过表达增强乙醇耐受的分子机制进oil biodegradation行了探究。首先构建了hfq过表达(ZM4-hfq)以及hfq敲除(ZM4-(35)hfq)重组菌株。在8%乙醇胁迫下,hfq过表达有效改善了ZM4的细胞生长,加速了葡萄糖消耗和乙醇生产;而ZM4-(35)hfq的乙醇耐受性则被明显抑制。ZM4和hfq重组菌株的转录组学研究结果表明乙醇胁迫导致了许多基因的差异表达,主要与细胞壁/膜生成、代谢、转录和一般应激反应有关。乙醇胁迫条件下hfq过表达鞭毛相关基因的下调可能为细胞生长保存能量。生化和遗传分析结果显示,hfq过表达参与了硫酸盐同化和半胱氨酸生物合成路径的正向调控,有助于消除乙醇抑制诱导产生的ROS(reactivselleck激酶抑制剂e oxygen species,ROS)。本研究也建立了一种新的蛋白互作分析方法——酵母内质网分离筛选(Yeast Endoplasmic Reticulum Sequestration Screening,YESS)系统,并将其应用于Hfq蛋白互作研究。YESS结果表明Hfq可能通过与Dna K/J的相互作用间接影响Rpo H活性,进而对Rpo H介导的细胞质应激反应进行调节。进一步将YESS系统与免疫共沉淀-质谱联用(Co-Immunoprecipitation-mass spectrometry,Co-IP-MS)方法结合,发现ZMO1690、ZMO0989等蛋白可能通过与Hfq结合增强Z.mobilis的乙醇耐受性。为解决Z.mobilis基因组编辑工具少的问题,本研究尝试了将Argonaute可编程核酸酶应用于Z.mobilis基因组编辑。首先,对来源于硫代热球菌(Thermococcus thioreducen)的Argonaute核酸酶(Ttd Ago)进行了体外表征。结果表明,Ttd Ago具备核酸内切酶的活性,对DNA靶标有着强烈偏好,可利用guide DNA在高温下切割ss DNA和ds DNA质粒,且其切割的效率和精确性受温度、二价金属离子、guide的磷酸化和长度及其与DNA靶标间互补性的影响。Ttd Ago发挥活性需要二价金属离子如Mn~(2+)、Mg~(2+)。Ttd Ago在30～95 ~oC的宽温度范围内可切割ss DNA,且在70～80 ~oC时活性较好。Ttd Ago至少需要16 nt guide DNA才可发进行切割,优先使用5’末端磷酸化的guide DNA,且对guide的5’末端核苷酸没有明显偏好;Ttd Ago对guide与靶标之间的碱基错配有相对较高的容忍度。Ttd Ago可利用单个或一对guide DNA来产生ds DNA断裂。此外,在Ttd Ago的体内表征中,本研究发现了Ttd Ago对Z.mobilis细胞具有毒性,导致生长速率和最终生物量降低,而hfq的过表达可以帮助缓解Ttd Ago的细胞毒性。初步研究也表明Ttd Ago在Z.mobilis中可能有编辑活性。综上所述,本研究系统研究了hfq过表达增强Z.mobilis乙醇耐受的分子机制,鉴定了与乙醇胁迫耐受相关的基因,为Z.mobilis乙醇耐受提供了遗传改造靶点。本研究也对可编程Ago核酸酶Ttd Ago进行了催化机理探究,拓宽了对原核Ago蛋白的认识;并初步鉴定了Ttd Ago在Z.mobilis的体内编辑活性,为开发基于Ago核酸酶的工业微生物基因组编辑工具奠定了基础。同时,本研究在Z.mobilis中建立的新型蛋白互作研究技术YESS系统也为研究原核微生物蛋白相互作用提供了一种新策略。