具有光学活性的手性醇在最近几年以来被用于合成一系列药物、农药和精细化学品。(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(R)-CHBE]是其中重要的手性醇药物中间体。(R)-CHBE是生产(R)-4-氨基-3-羟基丁酸、L-肉碱、(R)-4-羟基-2-吡咯烷酮、负霉素、大内酰亚胺A等的关键手性合成剂。利用羰基还原酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBdiABZI STING agonist纯度E)不对称还原加氢制备(R)-CHBE,是一种很有前景的合成途径。本文通过构建重组大肠杆菌CgCR不对称生物还原合成(R)-CHBE。相对于化学合成,生物催化还原反应条件温和,高选择性,转化率高。研究结果如下:首先,本研究成功地构建并鉴定了含有目的基因CgCR和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的重组大肠杆菌菌株CgCR。通过蛋白电泳,确定CgCR(43.9 k Da)和GDH(36 k Da)分子量。然后,以构建成功的重组菌CgCR作为催化剂,还原COBE合成(R)-CHBE。在pH 7.0、30℃时,底物COBE的反应动力学常数Km和kcat分别为20.9 m M和56.1 s~(-1)。本研究验证了E.coli CgCR催化COBE合成(R)-CHBE的可行性。其次,考察了温度、pH、辅底物、底物、金属离子等因素对合成(R)-CHBE的影响。在30℃、pH 7.0条件下、以金属离子Ni~(2+)(7 m M)、葡萄糖(3.5 m M葡萄糖/m M COBE)为辅底物的加入反应体系中、羰基还原酶CgCR可催化100 m M COBE在1.5 h内合成(R)-CHBE,产率为93.7%。在上述优化条件下,羰基还原酶可在12 h内催化600-800 m M COBE合成(R)-CHBE,产率为88%左右。此外,重组大肠杆菌CgCR高效催化1000 m M COBE转化为(R)-CHBE,产率为89.2%。由此可见,通过构建的重组E.coli CgCR合成(R)-CHBE具有更多潜在的应用前景。最后,为了进一步提hepatitis C virus infection高(R)-CHBE的产率,在上述优化后的条件下加入有机溶剂和低共熔溶剂(DES)。本研究在添加了7%(v/v)DES[甜菜碱:乳酸:Ni Cl_2=2:2:0.66(摩尔比)]和50%(v/v)的乙酸乙酯的条件下,E.coli CgCR在0.5 h内催化100 m M COBE转化为(R)-CHBE的产率为97.6%。考察了有机溶剂和DES对重组大肠杆菌CgCR细胞膜透性的影响。在反应体系中加入5%(v/v)的添加剂(DES和有机溶剂),反应1 h后测定离心上清液在OD_(260)和OD_(280)处的吸光度。与空白组(无添加剂)对比,在含有添加剂的反应体系中,大肠杆菌CgCR细胞膜的通透性提高了约2-10倍。将全细胞E.coli CgCR(OD_(600)=100)超声处理0-90 min,在上述优化体系(无添加剂)下催化100 m M COBE。研究发现经超声15 min的E.coli CgCR可催化合成(R)-CHBE的产率为94.5%。此外,本研究首次报道了在添加了50%乙酸乙酯和7%DES(甜菜碱:乳酸:Ni Cl_2=2:2:2.66)金属离子Ni~(2+)(7 m M),葡萄糖(3.5 m M葡萄糖/m M COBE)的条件下,全细胞大肠杆菌CgCR催化100 m M底物COBE在0.5 h内合成(R)-CHBE的产率97.6%。通过建立多相体系,为重组大肠杆菌CgCR不对称合成(R)-CHBE提供了一种新的可替代方式。综上所述,通过建立高效还原体系,利用羰基还原酶作为催化剂实现了(R)-CHBE的高效合成。本研究为工业化生产(R)-CHBE提供了参考依据。