金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一种常见的致病微生物和重要的医院内感染细菌。目前耐药和多耐药金黄色葡萄球菌的不断出现和传播,传统的抗生素治疗已经逐渐的失去作用。因此,急需开发研究新型有效的生物绿色抑制剂来控制金黄色葡萄球菌。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染细菌后期表达的能够消化细菌细胞壁的一种酶。它可以从外部通过破坏细菌细胞壁肽聚糖,导致细菌渗透性裂解,从而达到杀菌的效果。目前很多研究已经证实,裂解酶具有巨大的杀菌潜力。本研究中,我们从金黄色葡萄球菌的噬菌体中筛选到一个能够高效裂解金黄色葡萄球菌的新的噬菌体裂解酶,命名为LysDZ25。我们利用大肠杆菌表达体系对其进行表达和纯化,研究了其基本酶学性质,发现LysDZ25对血清和NaCl溶液均具有良好的耐受性,因此有较好点击此处的应用潜力。但是LysDZ25热稳定性较差,在37℃及以上温度保温20min活性基本丧失。为了提高LysDZ25的裂解活性和热稳定性,使用本实验室自主开发的机器学习方法(machine learning methods,MDL)理性设计突变体,通过两轮点突变及组合突变,获得了活性和热稳定性提高的突变体S333V/N245R/D299L。该突变蛋白裂解活性是LysDZ25的8倍,在37℃保温20 min活性几乎不减弱,40℃保温20 min活性保留三分之一。在37℃条件下,该突变蛋白的半衰期由LysDZ25的15 min提高到55-60 min。利用RoseTTAFold软件工具构建LysDZ25三维(3D)结构,发现LysDZ25包含三个结构域,即N端半胱氨酸和组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶催化结构域(CHAP)、中心酰胺酶催化结构域(AmiC)、C端细胞壁结合结构域(SH3b),结构域之间分别由两个连接序列(linker)L1和L2连接。我们通过构建AmiC和SH3b与GFP的融合蛋白和结构域重组蛋白,探究了各结构域的功能。研究结果表明在LysDZ25中,CHAP结构域发挥主要裂解活性,SH3b发挥结合金黄色葡萄球菌细胞壁的功能,首次发现AmiC具有结合金黄色葡萄球菌细胞壁的能力,且缺失后裂解活性有所提高。并且通过各结构域以及连接序列的组合,得到了具有更高裂解活性的重组蛋白CHAP+L1+SH3b和CHAP+L2+SH3b,裂解活性分别是LysDZ25的2倍和1.7倍。进一步对这两个结构域重组蛋白的连接序列进行截短,发现从N端向C端截去7-8个氨基酸,重组蛋白的裂解活性得到进一步提高。综上所述,本文利用大肠杆菌表达体系成功表达了金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysDZ25,并对其性质进行研究。通过理性设计和实验验证,我们获得了突变体蛋白,其裂解活性和热稳定性均有所提高,这将有助于该酶在实际生产中的应用,对噬菌体裂解酶BI 10773采购的分子改造有积极的指导意义。此外,我们还对LysDZ25的结构域进行拆分并探究各结构域的功能,在组合不同结构域和Cathodic photoelectrochemical biosensor连接序列后得到了具有更高裂解活性的重组蛋白。该工作对噬菌体裂解酶的分子改造有积极的指导意义,也为开发金黄色葡萄球菌的高效、新型生物抑制剂奠定了坚实基础。