目的:锰作为一种必需微量元素,在多种生理过程中都发挥着重要的作用。人体可通过多种途径接触锰。过量锰进入机体可通过血脑屏障对机体中枢神经系统造成不可逆损伤。血脑屏障是脑内重要的生理屏障,在维持大脑微环境稳态、控制各种金属离子进入脑内等方面发挥着重要作用。锰和铁在元素周期表中位置相邻,可共同由血脑屏障上部分转运体运送到脑内。过量锰暴露引起神经系统损伤的过程中,铁离子转Angiogenesis抑制剂运过程在其中扮演着重要的作用。Tf R1与膜FPN1在铁离子转运过程中发挥关键作用。锰中毒可使小鼠脑内铁离子含量增加,还可刺激脑内Tf R1高表达。锰可通过上调Tf R1的表达和增加Fe摄取诱导神经细胞铁过度积累。铁死亡主要是由于细胞内游离铁的增加以及脂质过氧化物的过度积累所介导。锰可诱导肿瘤细胞发生铁死亡。为探寻锰是否通过调控某种关键因子引起血脑屏障铁转运紊乱进而诱发神经元铁死亡,查阅文献发现锰暴露可改变Nrf2表达水平。Nrf2在铁离子转运过程中也扮演着重要作用。我们提出假设,锰通过Nrf2调控血脑屏障铁离子转运相关因子Tf R1和FPN1的表达影响脑内铁稳态进而引起神经元铁离子蓄积导致铁死亡。采用b End.3细胞构建染锰模型及Nrf2抑制剂模型探讨锰是否通过Nrf2影响铁转运相关因子Tf R1和FPN1的表达干扰脑内铁稳态。采用b End.3细胞和PC12细胞构建简易体外神经血管单元共培养模型,采取高铁模型及铁死亡抑制剂模型,探索锰能否引起脑内铁转运相关因子变化进而导致脑内铁离子堆积引起神经元铁死亡。本研究旨在探明Nrf2在锰引起血脑屏障铁转运紊乱进而引起神经元内铁离子堆积诱发神经元铁死亡致神经系统损伤的作用与机制,为深入研究锰损害神经系统功能的神经毒作用机制提供新思路和新靶点。研究方法:使用不同浓度的锰对小鼠脑微血管内皮细胞进行干预,CCK8实验评估锰对细胞活力的影响。镜下观察b End.3细胞形态;q RT-PCR及Western Blotting实验检测Nrf2、FPN1和Tf R1的m RNA及蛋白表达情况;使用亚铁荧光离子探针Ferro Orange检测细胞内Fe~(2+)水平;对细胞进行锰处理24h后使用TPL再处理6h,进一步验证Nrf2对铁转运因子FPN1和Tf R1的影响。构建体外神经血管单元锰暴露高铁和铁死亡抑制剂模型,利用Western Blotting实验技术检测FTH、GPX4和ACSL4蛋白表达水平;使用ATP检测试剂盒检测神经元内ATP含量变化;运用MDA试剂盒评估神经元内MDA水平;使用ROS检测试剂盒与线粒体膜电位试剂盒检测神经元内ROS及线粒体膜电位变化情况。结果:CCKNirogacestat体内8实验结果显示小鼠脑微血管内皮细胞b End.3细胞活力随着染锰剂量的增加而逐渐降低。镜下观察发现b End.3细胞数量减少且形状渐渐变圆。与对照skin biopsy组相比,小鼠脑微血管内皮细胞中铁离子水平下降,Nrf2、FPN1和Tf R1的m RNA及蛋白表达呈上升趋势,使用Nrf2抑制剂TPL干预后,Nrf2、FPN1和Tf R1的m RNA及蛋白表达出现回落趋势,铁离子水平也有所回升(P<0.05)。进一步验证锰促进铁离子跨越血脑屏障对神经元的影响,构建了体外神经血管单元锰暴露高铁模型。Western Blotting结果显示,FTH1和ACSL4蛋白水平较之对照组出现升高趋势,而GPX4蛋白表达水平下降(P<0.05)。与对照组相比,ATP和粒体膜电位水平呈现下降趋势(P<0.05)。结果显示,高铁与染锰联合组细胞内MDA及ROS水平增高(P<0.05)。对细胞进行铁死亡抑制剂Fer-1干预后,结果显示,与高铁染锰组相比,Fer-1+高铁染锰组ATP和线粒体膜电位水平均有回升,MDA及ROS水平都有回落趋势(P<0.05)。经Fer-1处理后,神经元内GPX4蛋白表达较之高铁染锰组有所增加,ACSL4蛋白表达较之高铁染锰组有所下降(P<0.05)。结论:1.过量Mn暴露可上调小鼠脑微血管内皮细胞内FPN1和Tf R1表达,使b End.3细胞内铁转运紊乱。2.Mn可通过激活Nrf2调控小鼠脑微血管内皮细胞内铁离子转运因子FPN1和Tf R1表达,导致b End.3细胞内铁离子排出增多。3.过量Mn暴露可促进铁离子跨越血脑屏障引起神经细胞内铁蓄积导致神经元铁死亡。