程序性死亡受体(Programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(Programmed cell death protein ligand 1,PD-L1)的相互作用可以抑制T细胞活化并阻碍其分泌细胞因子,从而促进肿瘤细胞免疫逃逸、免疫抑制等现象的发生。因此,阻断PD-1/PD-L1相互作用已经成为治疗癌症的一种有效手段。目前上市的PD-1或PD-L1抑制剂均为单克隆抗体,存在特异性强、组织/肿瘤穿透率低、半衰期长、口服生物利用度低、储存运输困难以及生产成本较高等缺点。与之相比,多肽制造成本更低、稳定性更高、免疫原性低并且具有更好的器官或肿瘤穿透能力,因此,PD-L1多肽抑制剂的开发具有独特的优势。本研究利用热点残基设计了32条PD-L1多肽抑制剂,并通过分子对接和分子动力学模拟进行虚拟筛选和优化,对得到的4条候选多肽在体外阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力、体外激活T细胞的能力以及体内免疫激活作用等方面进行考察,最终得到了4F-16和4F-32两条多肽。本论文共分为以下五部分:1.综述本章主要围绕肿瘤免疫疗法、载脂蛋白A-I(ApoA-I)模拟肽和计算机辅助药物设计研究进展进行了总结。首先回顾了肿瘤免疫疗法在国内外的研究进展,主要涉及细胞因子免疫疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、CAR-T细胞疗法和免疫检查点抑制剂等几种免疫疗法。然后介绍了ApoA-I蛋白及ApoA-I模拟肽的特性及相关应用。最后介绍了计算机辅助药物设计的常用方法,主要包括分子对接、分子动力学模拟的简介及其应用。本章所介绍的内容将为本研究提供理论依据,有助于研究的顺利进行。2.PD-1/PD-L1多肽抑制剂的设计本章通过分子对接,分析了五条已知的ApoA-I模拟肽(3F、4F、5F、ELK、L37PA)与PD-1和PD-L1的结合模式,筛选出与PD-L1具有高选择亲和力的ApoA-I模拟肽4F。同时,通过分别分析PD-1单抗、PD-L1单抗和已知的PD-L1多肽抑制剂与PD-L1的结合模式,确定了PD-L1的活性区域以及相互作用的热点残基,热点残基主要包括PD-1的Asn66、Tyr68、Gln75、Ile134、Ala132、Thr76、Lys78和PD-L1的Ala121、Asp122、Arg125、Asp26、Glu58、Glu60、Gln66、Tyr124、Phe19。最后使用热点残基对4F进行优化,考虑到PD-L1活Humoral immune response性区域主要是疏水界面且具有凹槽,优先选择疏水性氨基酸、苯丙氨酸或者酪氨酸等对候选多肽的特定氨基酸位点进行替换,通过疏水作用以及与凹槽形成互补的作用来增强候选多肽与PD-L1的结合,最终共设计了32条PD-L1多肽抑制剂。3.PD-L1多肽抑制剂的虚拟筛选本章首先通过分子对接技术初步筛选PD-L1多肽抑制剂:使用HPEPDOCK Server将32条多肽与PD-L1进行全原子对接,并以对接分数<-193、多肽与PD-L1形成的氢键个数≧5个、多肽与PD-L1的结合位点处于PD-1/PD-L相互作用区域等为标准筛选候选多肽,得到4F-8、4F-16、4F-30和4F-32四条多肽。随后,通过分子动力学模拟技术进一步探究4条候选多肽与PD-L1的动态结合情况,使用GROMACS动力学模拟软件分别将4条候选多肽与PD-L1进行100 ns动力学模拟。模拟结果表明4条多肽都能与PD-L1稳定结合且占据PD-L1的活性区域,并且通过MMPBSA方法计算得到的多肽与PD-L1的结合自由能分别为-45.262 k J/mol、-95.424 k J/mol、53.246 k J/mol和-161.825 k J/mol。4.PD-L1多肽抑制剂的体外活性评价本章首先使用均相时间分辨荧光共振能量转移技术测定候选多肽在体外阻碍PD-1/PD-L1相互作用能力。实验结果表明:4F-8阻断PD-1/PD-L1相互作用能力最强,IC_(50)值为0.206μM,其次是4F-32、4F-30和4F-16,IC_(50)值分别为1.251μM、1.420μM和2.977μM。随后,本章在体外利用MDA-MB-231乳腺癌细胞和Jurkat T细胞共培养以模拟细胞间相互作用,主要考察候选多肽的免疫激活能力,是否能有效促进Jurkat T细胞分泌IL-2。实验结果表明多肽4F-16和4F-32效果较为明显,在200μM的浓度下,IL-2分泌水平可分别达到110.106 pg/ml和144.208 pg/m L。最后,本章探究了候选多肽在小鼠血清中的降解情况,实验结果反映出多肽在血清中降解较快,其中降解速率最快的多肽是4F-16,可在1h内降解86.30%。因此,在后续PD-L1多肽抑制剂的体内研究中,选择瘤内注射的方式给药。5.PD-L1多肽抑制剂的体内免疫抗肿瘤活性研究本章通过构建4T-1荷瘤小鼠模型,考察候选多肽的体内免疫抗肿瘤作用。4F-16和4F-32组的抑瘤率可达69.31%和71.95%,表明这2条多肽可以有效抑制肿瘤的增殖;同时,多肽并没有影响小鼠体重的变化,表明候选多肽具有良好的耐受性和生物相容性。本章进一步使用ELISA方法考察了小鼠血清中细胞因子IL-4和IFN-γ的表达,结果表明:4F-16组IL-4和IFN-γ分泌水平可分别达207.36 pg/m L和654.26 ng/m L,是生理盐水组的2.64倍和2.38倍;4F-32组IL-4和IFN-γ分泌水平可分别达176.10 pg/m L和584.47 ng/m L,是生理盐水组的2.24倍和2.13倍。表明4F-16和4F-32可有效增强T细胞介导的免疫应答,达到抗肿瘤效果。最后使用免疫组化方法考察了荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8~+T细胞、GZMB和IFN-γ的表达,结果显示,4F-16和4F-32组的CD8~+T细胞、GZMB和IFN-γ的表达均显著高于生理盐水组,表明Z-VAD-FMK价格4F-16和4F-32具有增强体内抗肿瘤免疫应答的作用。综上所述,本研究基于PD-1/PD-L1相互作用的特点,设计了多条PD-L1多肽抑制剂,并通过分子对接和分子动力学模拟技术对多肽进行虚拟筛选,最后通过体内外实验,验证得到4F-16和4F-32两条多肽,具有阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力,并且激活T细胞介导的免疫应答,表现出显著的抗肿瘤效果。本研究开发的PD-L1抑制剂为肿瘤免疫治疗提供CHIR-99021采购新的候选药物。