原发性肝癌为世界范围内第6位最常见癌症和第3位癌症死亡原因。肝癌起病隐匿,进展迅速,易发生肝内及肝外转移,因此寻找更加安全有效的干预手段,对于肝癌的治疗及预后具有重要意义。肠道菌群是人体中最为复杂的组成部分之一,肠道菌群组成和功能的变化与人类多种获悉更多疾病的发生和发展有着密切联系。研究表明,阿克曼菌(Akkermansia muciniphila,Akk)的丰度变化明显与肝癌患者病程进展密切相关。近年来发现,肠道细菌释放的细菌源性囊泡(bacterial extracellular vesicles,BEVs)可能是细菌与机体之间的重要通讯途径之一。本文旨在探究Akk是否通过分泌BEVs进入循环的方式影响肝癌的发生发展,同时阐明BEVs的具体作用分子及作用机制。1.研究目的1.1明确Akk在肝癌发生发展中的作用;1.2揭示Akk发挥作用的途径,明确Akk-EVs与肝癌进展的相关性;1.3发掘Akk-EVs的特定作用分子并明确其机制。2.方法2.1 Akk与肝癌Parasite co-infection发生和发展相关性研究:(1)构建自然发生(NASH-HCC)肝癌小鼠模型,收集小鼠粪便,比较肝癌小鼠与正常小鼠肠道中的Akk丰度差异;(2)灌胃补充Akk后,检测NASH-HCC模型小鼠肝脏发生肿瘤情况;(3)构建肝癌转移模型,同样灌胃补充Akk,测定小鼠肿瘤转移情况及生存率等相关指标。2.2明确Akk是否通过分泌EVs进入机体循环影响肝癌进展:(1)将Akk此网站-EVs刺激后的肝癌细胞移植到小鼠皮下,检测发生肿瘤大小等指标;(2)采用Akk-EVs对肝癌细胞进行处理,体外测定其增殖及迁移侵袭能力的改变。2.3揭示Akk-EVs的作用分子,阐明相关作用机制:(1)利用全基因组分析和蛋白质谱筛选出具有相关功能的潜在分子,通过相关体内外实验,进一步确定Akk-EVs的具体作用分子;(2)用筛选出来的Akk-EVs效应分子刺激肝癌细胞,随后进行RNA测序,分析基因表达量变化,初步筛选并验证相关作用通路。3.结果3.1肝癌小鼠肠道内Akk丰度明显降低,而补充Akk后肿瘤发生率和转移率下降。3.2 Akk-EVs干预的肝癌细胞在体内形成肿瘤较小,小鼠生存率高。肝癌细胞与Akk-EVs共培养后,增殖和转移侵袭能力明显下降,EMT样转化减少。3.3通过全基因组和质谱分析初步猜想Akk膜蛋白Akk_M8可能是Akk-EVs发挥抗肝癌作用的效应分子,转录组和Western blot结果表明Akk_M8可能以促进肝癌细胞铁死亡的方式抑制肝癌进展。4.结论体内外实验证明Akk及其分泌的EVs能够降低肝癌的增殖及侵袭迁移能力,全基因组,蛋白质谱分析和转录组学结果表明,Akk-EVs的膜蛋白Akk_M8极有可能是抑制肝癌进展的功能分子,能够促进铁死亡相关基因表达,从而抑制肝癌细胞增殖及转移扩散。上述发现将为细菌与宿主之间通讯交流研究开辟新的方向,同时为今后开发基于Akk的有效癌症疫苗或辅助药物治疗提供了新的策略。