脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种具有高发病率和死亡率的破坏性脑部疾病。全球范围内,脑出血患者人数接近两千万人,占所有脑卒中患者的10-15%,波及范围巨大,年死亡率超过50%。近年来,发病人群呈现年轻化趋势。脑出血后的继发性脑损伤,会引起患者神经功能障碍,进而导致患者生活无法自理,加重患者家庭和社会负担。因此,有必要对脑出血及其继发性脑损伤展开深入的研究探索,为临床脑出血的治疗提供新的思路。脑出血发生后,血细胞进入脑实质,被分解成为铁离子、血红素和凝血酶等可诱发自由基产生的物质,导致神经损伤;这些Canagliflozin临床试验分解产物还能诱发炎症,募集免疫细胞清除血块或加剧炎症反应,进一步造成脑损伤。氧化应激在脑出血后的继发性脑损伤中起重要作用,这主要由于氧化应激在脑出血病理过程及其病理生理反应阶段皆发挥一定的作用。免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)参与脑出血后的炎症反应,其中,巨噬细胞是在脑出血发生后,首先被募集的细胞之一。巨噬细胞通过不同的极化倾向,发挥促炎或者抑炎的作用。ITGB1(integrinbeta 1)是整合素家族的一员,在脑组织中具有广泛的表达。脑出血后,ITGB1会在脑组织中被高度表达,并在神经元凋亡、血管损伤、神经炎症反应和脑水肿发生中发挥重要作用;除此之外,ITGBI还与血脑屏障的破坏有关。另外,ITGB1对于调节血管的形成和稳定性、细胞粘附等方面发挥着关键作用。ITGB1对包括巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞具有重要的调控作用,并通过与其他蛋白结合来参与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等生理过程。在内皮细胞中,ITGB1作为细胞外基质和细胞内信号转导中的重要组分发挥着重要作用,并可对内皮细胞的粘附和生长等生物学功能发挥调控作用。阿托伐他汀是一种适用于心脑血管疾病(如冠心病)的他汀类药物,许多研究证明它能够抑制氧化应激、保护心血管功能、抑制炎症等。然而,在脑出血的治疗中,阿托伐他汀的作用是否确切仍存在争议。因此,本研究旨在通过体内、体外实验,证实阿托伐他汀在脑出血中的治疗作用,并阐明其可能的治疗机制:通过调控ITGB1抑制脑出血后内皮细胞凋亡、炎症反应、氧化应激及屏障功能损伤。本研究内容验证了阿托伐他汀在脑出血中的治疗价值,完善了脑出血后脑损伤及他汀干预有效的分子机制,为进一步可能的药物靶点的开发提供了基础和线索。第一部分:脑出血后动物ITGB1的表达特征、氧化应激、炎症反应水平的研究1)研究目的:本实验旨在探究大鼠脑出血后24h和72h的脑组织中炎性反应、氧化应激、血脑屏障功能及ITGB1表达水平的特征。2)研究方法:采用胶原酶VII法,建立SD大鼠脑出血模型,并在24 h和72 h时,收集脑组织和血清样本,采用H&E染色对脑组织病理情况进行观察,采用TUNEL染色对脑组织凋亡情况进行观察;采用伊文思蓝渗透法,并结合qRT-PCR方法检测MMP2、MMP9及Occludin和Claudin-5表达水平,评估动物血脑屏障功能;ELISA方法检测动物血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平,采用qRT-PCR和Western blot方法检测脑组织中ITGB1表达水平;根据试剂盒方法检测脑组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和 8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHdG)水平;3)研究结果:随着时间的推移,在脑出血模型组中,神经元损伤逐渐加剧,72h时达到最高水平,同时凋亡水平也随之增加。72h时,伊文思蓝渗透水平达到最高值,并伴随着Occludin、Claudin-5的表达水平下调和MMP2、MMP9的表达水平上调。在模型组中,炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显上调,尤以72h时表现最为明显。SOD水平在模型组中呈现下调趋势,同时伴随ITGB1表达的上调,MDA和8-OHdG水Nirogacestat体外平也呈现出上调趋势。4)小结:胶原酶VII成功诱导大鼠脑出血模型,该脑出血动物模型随时间推移,表现出氧化应激加剧、炎性因子增加、血脑屏障功能受损,并伴随着逐渐升高的ITGB1表达。因此,ITGB1的上调可能与脑出血后的继发性损伤存在相关性。第二部分:阿托伐他汀通过ITGB1干预脑微血管内皮细胞参与下的脑出血继发性脑损伤1)研究目的:本部分实验旨在研究阿托伐他汀是否通过调节ITGB1的表达来进一步影响脑微血管内皮细胞的屏障功能、凋亡程度、炎症反应和氧化应激。2)研究方法:a.通过培养脑微血管内皮细胞,并采用血红素(hemin)处理细胞,诱导脑出血体外模型。在使用阿托伐他汀处理后,检测内皮细胞中ITGB1的表达水平。随后,将内皮细胞与巨噬细胞共培养,并对内皮细胞的屏障功能、凋亡水平、炎症反应及氧化应激进行检测。b.设计并合成针对ITGB1的siRNA,并利用qRT-PCR和Western blot方法对siRNA的干扰效率进行检测。c.在基于Hemin诱导的脑出血体外模型中,使用siRNA对ITGB1进行表达干扰。之后将内皮细胞与巨噬细胞进行共培养,对内皮细胞的屏障功能、凋亡水平、炎性反应及氧化应激进行检测。d.在脑出血体外模型中,经过阿托伐他汀处理后,进行ITGB1过表达处理。然后将内皮细胞与巨噬细胞共培养,进一步分析内皮细胞的屏障功能、凋亡水平、炎性反应及氧化应激。3)研究结果:a.在经过血红素处理的内皮细胞中,ITGB1的表达显著升高;与此同时,在与巨噬细胞共培养之后,内皮细胞的屏障功能明显受损,伴随着炎症反应和氧化应激的加剧以及凋亡水平的提高。然而,在使用阿托伐他汀进行处理之后,内皮细胞的屏障功能改善,且炎症反应和氧化应激以及凋亡水平都得到了缓解,并且ITGB1的表达水平受到了抑制。b.在实验中,siRNA#2表现出最高的敲除效率。c.在血红素诱导的脑出血体外模型中,ITGB1 siRNA可以显著地抑制ITGB1的表达水平,同时能够逆转模型组细胞中内皮细胞屏障功能的损伤、过度的炎症反应和氧化应激,以及凋qPCR Assays亡水平的上升。d.在血红素诱导的模型组细胞中,ITGB1的过表达能够显著逆转阿托伐他汀对内皮细胞屏障功能的保护作用,并再次上调了内皮细胞的炎症反应、氧化应激和凋亡水平。4)小结:a.经血红素处理后,脑微血管内皮细胞产生在巨噬细胞参与下的细胞屏障功能受损,并伴随氧化应激、炎症反应和凋亡水平加剧;b.对内皮细胞中ITGB1进行敲降后,可对巨噬细胞参与下的内皮细胞屏障功能损伤、氧化应激和炎症反应过激、凋亡水平上调发挥抑制作用;c.阿托伐他汀主要通过调控ITGB1表达发挥对内皮细胞的保护作用。第三部分:阿托伐他汀通过调控ITGB1对脑出血血脑屏障损伤的保护机制1)研究目的:体内实验证实,阿托伐他汀通过调节ITGB1可以抑制脑组织内血脑屏障功能的损伤,并降低组织内氧化应激、凋亡水平和炎症反应。2)研究方法:采用胶原酶VII诱导大鼠动物模型,使用阿托伐他汀作为治疗药物,并利用腺相关病毒对动物脑组织ITGB1进行过表达;检测各组动物脑组织血脑屏障功能(伊文思蓝渗透情况、MMP2、MMP9、Occludin和Claudin-5表达水平)、炎症反应水平(IL-1β、IL-6和TNF-α)、氧化应激水平(SOD、MDA和8-OHdG)、凋亡水平;并采用免疫组化方法,检测动物脑组织中巨噬细胞(IBA1)、M1型巨噬细胞(CD86)、M2型巨噬细胞(CD163)的分布情况。3)研究结果:a.在模型组中,阿托伐他汀具有抑制ITGB1表达,下调脑组织氧化应激、炎症反应、血脑屏障损伤及细胞凋亡的作用,且对M1型、M2型巨噬细胞极化分别表现出抑制、促进作用;b.ITGB1过表达逆转了阿托伐他汀对氧化应激、炎症反应、血脑屏障损伤及细胞凋亡的抑制作用,并对M1型、M2型巨噬细胞极化分别表现出促进、抑制作用。4)小结:在脑出血动物模型中,阿托伐他汀具有通过调控ITGB1表达,抑制氧化应激、炎症反应、血脑屏障损伤和细胞凋亡的作用,并对M1型、M2型巨噬细胞极化分别表现出抑制、促进作用。结论:阿托伐他汀在脑出血模型中可通过调控ITGB1表达,抑制脑出血后组织中的氧化应激和炎症反应引发的继发性脑损伤,起到脑保护作用。