多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是以骨髓中的克隆性浆细胞异常积聚并过度分泌一种单克隆免疫球蛋白为特征的恶性血液肿瘤。第二代度胺类免疫调节剂来那INCB018424说明书度胺(Lenalidomide,LENA)为MM的临床一线用药,通过泛素-蛋白酶体途径实现对底物蛋白IKZF1和IKZF3的降解,从而抑制MM细胞增殖。度胺类药物临床使用中不仅存在原发性耐药现象,同时存在长期使用后出现的获得性耐药问题。究其原因耐药问题的出现,常伴随着度胺类化合物对肿瘤细胞增殖起关键作用的IKZF1和IKZF3等底物蛋白降解能力的下降,从而降低药物的治疗效果。因此,对度胺类化合物不敏感和耐药的MM患者来说,聚焦度胺类化合物的底物蛋白,研究开发更有效的药物十分必要。雷公藤内酯酮(Triptonide,TPN)为卫矛科植物雷公藤的主要有效成分之一,具有抗肿瘤、避孕和免疫抑制等药理活性,本实验前期发现TPN对MM细胞有较强的增殖抑制作用,进一步研究发现其可通过抑制MM细胞内IKZF1和IKZF3的基因转录来降低相关蛋白的表达,存在克服MM细胞对度胺类化合物耐药的可能。本课题从临床上实际存在的MM对度胺类化合物耐药问题的角度出发,评价TPN对原发性和获得性耐药多发性骨髓瘤细胞的增殖、周期、凋亡及蛋白表达的影响,为解决目前临床上出现的MM患者对度胺类化合物的耐药问题提供实验数据上的支撑。目的:探讨TPN对度胺类药物原发性耐药RPMI-8226细胞、获得性耐药NCI-H929R细胞增殖的作用及机制。方法:MTS比色法检测化合物对MM.1S、RPMI-8226、NCI-H929和NCI-H929R细胞增殖能力的影响;Western blot法检测化合物对MM.1S、RPMI-8226、NCI-H929和NCI-H929R细胞内IKZF1、IKZF3、Caspase3和cleaved-caspase3蛋白表达的影响;RT-q PCR法检测TPN对MM.1S细胞内IKZF1和IKZF3基因转录的影响;流式细胞术检测LENA、POMA和TPN对MM.1S、RPMI-8226、NCI-H929和NCI-H929R细胞周期与凋亡的影响。结果:1.TPN具有较强的抑制度胺类药物敏感的MM.1S细胞增殖的能力,并可通过抑制细胞内IKZF1和IKZF3的基因转录来降低蛋白的表达基于表型筛选策略对部分中药成分抗MM细胞增殖活性进行测试,并从临床使用安全性角度考虑,最后选取了TPN作为主要研究对象,结果显示TPN对MM.1S细胞具有较强的增殖抑制作用,究其原因TPN可抑制细胞内IKZF1和IKZF3的蛋白表达,这一现象与度胺类药物特点一致。而进一步的机制研究发现,TPN通过下调IKZF1和IKZF3 m RNA转录水平而抑制相关蛋白的表达,这一特点证实TPN具有不同于度胺类药物抑制IKZF1和IKZF3的蛋白表达的作用机制,提示TPN在耐药细胞株上同样具有抑制相关蛋白表达的能力。2.TPN抑制原发性耐药细胞RPMI-8226细胞增殖,促进RPMI-8226细胞凋亡LENA和POMA可通过降解度胺类化合物敏感MM细胞MM.1S细胞内IKMedial preoptic nucleusZF1和IKZF3抑制MM.1S细胞增殖,对细胞G_0/G_1期有阻滞作用,可促进MM.1S细胞凋亡;而对RPMI-8226细胞内IKZF1和IKZF3降解作用变弱且无明显增殖抑制效果,同时对细胞周期及凋亡均无明显影响。相较于度胺类药物,TPN对MM.1S和RPMI-8226细胞均有较强的增殖抑制作用,并可抑制细胞内IKZF1和IKZF3蛋白表达,促进细胞凋亡,低浓度下可阻滞MM.1S的G_Tezacaftor0/G_1期,可促进细胞内cleaved-caspase3的表达,提示TPN可通过抑制IKZF1和IKZF3蛋白表达抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,说明TPN不仅对可强效抑制度胺类药物敏感多发性骨髓瘤细胞的增殖,还可克服度胺类药物原发性耐药问题。3.TPN抑制获得性耐药细胞NCI-H929R细胞增殖,促进NCI-H929R细胞凋亡通过200 nM POMA长期给药构建NCI-H929 POMA耐药细胞株NCI-H929R,Western blot结果显示POMA耐药后细胞内CRBN表达量明显减少。在NCI-H929细胞中,POMA可通过降解细胞内IKZF1和IKZF3,促进NCI-H929细胞凋亡而抑制NCI-H929细胞增殖,;而在NCI-H929R细胞内,POMA对细胞内IKZF1和IKZF3基本无降解作用并对细胞增殖无明显影响,同时对NCI-H929R的细胞周期及凋亡皆无明显影响。TPN对NCI-H929和NCI-H929R细胞均有较强的增殖抑制作用,并均可抑制细胞内IKZF1和IKZF3蛋白表达,促进细胞凋亡,并可促进细胞内cleaved-caspase3的表达,提示TPN可通过抑制IKZF1和IKZF3蛋白表达抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,克服多发性骨髓瘤对度胺类化合物的获得性耐药问题。结论:TPN可通过抑制MM细胞内IKZF1和IKZF3基因的转录,下调相关蛋白的表达,抑制MM细胞增殖,促进MM细胞凋亡,可克服MM对度胺类化合物的原发性耐药和获得性耐药问题。