青稞茶(Highland barley tea,HBT)是以青稞籽粒为原料经烘烤后制成的一种谷物茶,富含天然活性成分,长期饮用能有效降低代谢性疾病的患病风险。目前我国已经正式步入老龄化社会,老年个体广泛出现机体器官功能退化并由此产生慢性代谢疾病,其中骨骼肌功能的衰退严重影响了老年人的生活质量,并制约了社会经济发展。因此探究HBT对老Two-stage bioprocess年人群骨骼肌健康的影响对改善老年人群的健康状态和减轻社会医疗负担具有重要的科学和社会意义。本论文拟通过自然衰老小鼠模型探究长期饮用HBT对骨骼肌衰老的影响,结合体外骨骼肌衰老细胞模型对潜在的功能性组分进行筛选,利用分离纯化及质谱技术对功能组分进行富集、鉴定及活性分析;通过动物和细胞模型www.selleck.cn/products/Etopophos探究功能组分抑制骨骼肌衰老的潜在分子机制;最后利用分子生物学技术对小鼠骨骼肌中潜在调控基因进行鉴定并对其进行特异性敲除,最终明确HBT改善骨骼肌衰老的作用机制。主要研究内容如下:(1)探究长期饮用HBT对衰老小鼠生理状态以及骨骼肌功能的影响。用HBT替代饮用水对自然衰老小鼠进行持续时间为5个月的长期干预,之后对小鼠基础生理指标、炎症、血浆代谢物、骨骼肌功能及运动能力进行测定,探究长期饮用HBT对小鼠衰老的影响。结果表明长期饮用HBT可以降低衰老小鼠的体重和脾脏的重量,增加骨骼肌的体重占比并降低小鼠血浆炎症水平。血浆中线粒体标志物短链酰基肉碱以及部分氨基酸含量增加,部分胆汁酸及长链酰基肉碱的含量降低。衰老小鼠腓肠肌中纤维化的水平受到抑制,I型肌纤维的比例增加进而提升小鼠的耐力。因此,长期饮用HBT可以降低衰老小鼠炎症水平和缓解线粒体损伤,增加骨骼肌线粒体活性和运动能力。(2)通过体外模型对HBT调节骨骼肌衰老的潜在组分进行鉴定及活性探究。利用棕榈酸(PA)处理小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12),构建小鼠骨骼肌体外线粒体损伤的衰老模型。以LC-MS测定的酰基肉碱相对表达水平和Seahorse检测的细胞线粒体呼吸能力为重要依据,验证细胞模型的有效性。将HBT茶汤分为了醇溶(AS)和水溶(WS)两个组分,对两个组分的基本成分及体外抗氧化活性进行测定,并通过骨骼肌体外线粒体损伤模对AS和WS的骨骼肌线粒体损伤的调节作用进行研究。结果表明,AS主要成分为多酚黄酮为主的小分子化合物,WS的主要成分为可溶性碳水化合物。因此,AS展现出更高的抗氧化活性,并能有效缓解PA诱导的骨骼肌线粒体损伤。进一步研究发现,AS可以通过AMPK/SIRT3/Fox O3a通路抑制细胞内蛋白的乙酰化水平、线粒体氧化损伤和线粒体介导的细胞凋亡。基于以上结果明确酚类物质是HBT调节骨骼肌衰老的功能组分。(3)对HBT中酚类物质进行富集、纯化、定性以及定量分析,并对其线粒体调节活性进行探究。通过大孔吸附树脂结合动态吸附对青稞茶粗多酚(CHBP)进行纯化,利用UPLC-TOF-MS对纯化后的多酚进行定性和定量分析,并探究酚类物质的活性。结果显示,经AB-8大孔吸附树脂动态吸附纯化后,青稞茶酚类物质(HBP)总酚含量大幅度提高,纯化后酚类物质中鉴定出28种酚类物质单体。定量结果显示原花青素B3是纯化多酚中含量最多的化合物,其次是没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、芦丁、山奈酚、儿茶素以及木犀草素。线粒体调节活性结果显示HBP、CHBP、原花青素B3可以缓解PA诱导的线粒体损伤,儿茶素、原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸可以改善线粒体的部分功能,其中HBP活性高于CHBP以及单体多酚。(4)探究不同剂量HBP对衰老引起的肌萎缩和晚期糖基化终末产物(AGEs)的抑制作用,探究衰老进程中AGEs对骨骼肌的影响。结果表明,D-半乳糖诱导的衰老会增加小鼠血清和比目鱼肌中AGEs的含量,降低比目鱼肌质量和线粒体功能蛋白SIRT3表达,并增加肌萎缩相关基因Atrogin-1的表达。中高剂量的HBP干预可以有效缓解上述情况,降低衰老小鼠体内氧化应激的水平。进一步研究发现,AGEs可以降低C2C12细胞中去乙酰化酶3(SIRT3)的表达,导致肌萎缩和线粒体氧化应激,而HBP能够有效抑制体外与体内AGEs的生成,且抑制率与HBP浓度呈正相关。中高剂量HBP可以通过抑制AGEs形成从而缓解骨骼肌的衰老。此外明确了HBP动物实验的最佳干预浓度为100 mg/kg/bw。(5)探究HBP对衰老Emricasan引起的骨骼肌纤维化的影响,并明确潜在介导的基因。利用D-半乳糖和骨骼肌钝挫伤构建体内和体外骨骼肌纤维化模型,进一步探究HBP对衰老引起的骨骼肌纤维化的作用及潜在机制。结果表明,D-半乳糖会增加小鼠骨骼肌衰老及纤维化相关指标,包括氧化应激水平、β-半乳糖苷酶含量、炎症水平、细胞乙酰化水平、以α-SMA为代表的骨骼肌纤维化标记物表达水平等,并降低SIRT3的表达。而HBP的干预可以有效缓解D-半乳糖诱导的骨骼肌细胞衰老及纤维化。值得注意的是,C2C12细胞中的SIRT3被沉默后会加剧D-半乳糖诱导的骨骼肌损伤及纤维化,并且HBP的干预效果也降低,表明SIRT3是介导HBP改善骨骼肌衰老及纤维化的重要基因。(6)探究SIRT3介导HBP的对骨骼肌衰老的影响。通过基因编辑与重组技术,构建骨骼肌SIRT3特异性敲除小鼠(mSIRT3 KO)。对成年后小鼠体重及骨骼肌相关指标进行测定发现,成年后mSIRT3 KO小鼠的体重降低,腓肠肌及比目鱼肌质量减少,腓肠肌纤维类型由氧化型肌纤维(I型)向糖酵解肌纤维(II型)转化,肌萎缩及纤维化相关基因的表达水平增加,小鼠力量及耐力降低,炎症及氧化应激水平增加。HBP的干预无法缓解骨骼肌特异性敲除SIRT3造成的骨骼肌衰老,但可以部分缓解炎症。结果表明SIRT3在调节骨骼肌衰老过程具有重要作用,是介导HBP抑制骨骼肌衰老的重要基因。综上所述,青稞中的酚类物质是青稞茶调节骨骼肌衰老的重要功能组分,可以通过抑制AGEs、炎症以及氧化应激等多种途径缓解骨骼肌衰老,其中SIRT3在调节骨骼肌衰老过程中具有重要作用。本研究为青稞资源的高效利用以及谷物健康饮品的研发提供了新思路与理论支持。