背景拷贝数变异(copy number variations,CNVs)在许多疾病的发生发展中发挥着重要作用。然而在非手术性甲状旁腺功能减退症(non-surgical hOil biosynthesisypoparathyroidism,ns-HP)患者中,仍缺乏其CNV的发生率数据及其与ns-HP表型相关性的研究。目的对本中心儿童/青少年发病的特发性甲状旁腺功能减退症(idiopathic hypoparathyroidism,IHP)患者及 DiGeorge 综合征-1(DiGeorge syndrome,DGS-1)相关性HP患者进行CNV(≥100kb)的筛查,探讨其发生率以及CNV与HP临床表型的相关性。方法研究对象包括两部分:(1)1975年至2021年期间在北京协和医院内分泌科就诊和随访的198例儿童/青少年起病的ns-HP患者,结合病史及靶向二代测序(targeted next-generation sequencing,T-NGS)/全外显子测序(whole exome sequencing,WES)联合TBX1-多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification assay,MLPA)筛查,纳入未发现候选致病基因罕见变异或归类为良性/可能良性变异的IHP患者。(2)1975年至2021年期间在北京协和医院内分泌科就诊和随访的ns-HP(包括198例儿童/青少年起病和97例成年起病)患者,结合病史及T-NGS/WES联合TBX1-MLPA筛查,纳入发现TBX1有大片段缺失或存在被归类为致病/可能致病的TBX1变异的HP患者。回顾性收集上述患者的临床资料,包括一般临床资料、HP相关的临床表型、实验室检查及慢性并发症等。提取患者外周血DNA,通过低深度全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)检测纳入患者的 CNV(≥100kb)。比较 CNV阳性及阴性IHP患者、不同CNV负荷(每例患者携带的CNV总碱基数)的IHP患者、是否携带22q11以外CNV的DGS-1患者的HP相关临床表型的差异,并比较DGS-1相关性HP患者与IHP患者间CNV(≥100kb)发生情况的差异。结果共有125例IHP患者和34例DGS-1相关性HP患者进行了 CNV(≥100kb)检测和分析。1.在125例IHP患者中:(1)CNV(≥100kb)发生频率及长度:55例(44.0%)患者携带83个CNV(≥ 100kb),长度为 100kb-2640kb(中位数为 280kb),包括 63 个(75.9%)重复、20个(24.1%)缺失。64个(77.1%)CNV的基因座与已知基因重叠,但其中不包括任何已知的HP致病基因。(2)在CNV(≥100kb)阳性和阴性组间:除末次随诊时儿童患者尿钙水平(0.105[0.080,0.129]vs.0.044[0.017,0.079]mmol/kg/24h,P=0.01)外,两组患者HP相关临床表现、血钙及甲状旁腺素水平、慢性并发症发生情况、药物剂量等无显著差异。携带较大CNV(≥400kb)者较CNV阴性患者记忆力下降比例较高(13/15,86.7%vs.17/33,51.5%,P=0.02)。(3)将CNV(≥100kb)阳性患者根据CNV负荷按照三分位分为三个亚组(100-320 kb、360-600 kb 和 620-2640 kb):除初诊时血游离钙水平(0.5[0.4,0.5]vs.0.8[0.6,0.9]vs.0.7[0.6,0.9]mmol/L,P=0.03)外,三组患者 HP 相关临床表现、慢性并发症发生情况、药物剂量等无显著差异。(4)在两例患者中发现两种ACMG分级为致病性变异(15q11.2上0.34Mb的缺失)和可能致病性变异(16p13.11上1.18Mb的重复)的CNV(≥100kb),但两种CNV已知临床表型与HP不相关,两例患者也无两种CNV相应临床表现。2.在34例DGS-1相关性HP患者中:(1)CNV(≥100kb)发生频率及长度:32例(94.1%)患者经低深度WGS证实存在22q11的致病性CNV(≥100kb)。15例(44.1%)患者携带22个22q11以外的CNV(≥100kb),长度为120kb-1840kb(中位数为280kb),包括16个(72.7%)重复、6个(27.3%)缺失。16个(72.7%)CNV的基因座与已知基因重叠,但其中不包括已知的HP致病基因。(2)在是否携带22q11以外CNV(≥100kb)阳性和阴性组间:除初诊时成人尿钙水平(1.5±0.6 vs.4.7±2.9mmol,P=0.04)、末次随诊时血镁水平(0.7±0.03 vs.0.8±0.06 mmol/Liraglutide溶解度L,P=0.02)外,两组患者HP相关临床表现、血钙及甲状旁腺素水平、慢性并发症发生情况、药物剂量等无显著差异。(3)DGS-1相关HP患者与IHP患者间:除22q11微缺失外,两组之间的CNV(≥100kb)发生率无显著差异(15/34 vs.16/34,P=0.81)。DGS-1 组和 IHP组患者在以下指标存在显著差Protein Tyrosine Kinase抑制剂异:发病年龄(7.0[0.7,13.3]vs.12.5[8.0,15.0]岁,P=0.01)、初诊时血游离钙和血碱性磷酸酶水平(分别为0.9±1.0vs.0.7±0.2mmol/L,P=0.02;164.6±98.5U/L vs.100.8±63.4U/L,P=0.01)、智力下降发生率(27/31,87.1%vs.4/14,28.6%,P=0.00)及末次随诊时血碱性磷酸酶水平(104.6±56.8 vs.74.8±32.2 U/L,P=0.01)及智力下降发生率(28/32,87.5%vs.5/17,29.4%,P=0.00)。结论1.在本组大样本儿童/青少年发病的IHP患者中:(1)44.0%的患者检出长度≥100kb的基因组拷贝数变异。(2)未发现携带CNV(≥100kb)的IHP患者与未携带的IHP患者之间HP临床表现有显著差异,需要更大样本量、前瞻性研究进一步探索。2.在本研究纳入的34例DGS-1相关HP患者中:(1)44.1%的患者携带除22q11微缺失以外CNV(≥100kb)。(2)未发现CNV(≥100kb)发生情况与DGS-1患者HP相关表型显著相关,需要更大样本量的进一步研究。背景甲状旁腺功能减退症(hypoparathyroidism,HP),简称甲旁减,是由甲状旁腺素(parathormone,PTH)缺乏导致的一种罕见内分泌疾病。位于染色体11p15.3的PTH基因的突变是导致家族性孤立性甲状旁腺功能减退症(familial isolated hypoparathyroidism,FIH)的罕见原因之一。到目前为止,已报告10个可能与FIH相关的PTH基因变异。目的本研究拟对本中心既往发现的PTH基因罕见变异(rare variation,RV)进行体外功能实验,分析罕见的PTH基因变异对甲旁减患者PTH合成与分泌的影响。方法研究对象为既往本研究组应用靶向二代测序(targeted next-generation sequencing,T-NGS)在非术后甲旁减患者中筛查出携带PTH基因罕见变异的3例患者。回顾性收集患者的临床资料:一般特征、HP相关临床表型、实验室检查及慢性并发症等。对上述变异进行Sanger测序验证及生信分析,包括保守性预测、致病性预测、蛋白结构功能预测等。构建野生型(wild-type,WT)和突变型PTH质粒并转染人胚肾(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞进行体外功能验证。在4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)处理之前及处理48小时后,分别采用化学发光法测定培养基中完整PTH(intactPTH,iPTH)和PTH(1-84)的水平以及用蛋白质印迹法(Western blotting,WB)测定细胞中PTH蛋白的表达水平。结果本研究共纳入3例携带PTH基因罕见变异的患者,包括2例女性和1例男性,起病年龄分别为21、44、1 1岁,均以低钙血症相关症状起病,1例患者发生颅内钙化。其PTH罕见变异分别为NM_001316352:c.A1G:p.Gly2_Met5del(NP_001303281)、NM_000315:c.G 154A:p.Va152Ile(NP_000306)和 NM_000315:c.270G>T:p.Leu90Phe(NP_000306)。体外功能验证结果显示:(1)与WT相比,转染Gly2_Met5del突变型PTH细胞的培养基中iPTH/PTH(1-84)的水平以及细胞内蛋白表达水平没有显著差异;(2)转染 Val52Ile 突变型 PTH(iPTH:10826.7±83.4 vs.7338.7±108.9pg/ml,P<0.05;PTH(1-84):7778.7±51.4 vs.6296.0±135.1pg/ml,P<0.05)和 Leu90Phe突变型 PTH(iPTH:10826.7±83.4 vs.402.3±16.7pg/ml,P<0.01;PTH(1-84):7778.7±51.4 vs.4041.3±342.7 pg/ml,P<0.05)细胞的培养基中 PTH 水平明显减低,但其胞内蛋白表达能力较WT无显著差异;(3)4-PBA的添加仅部分增加了转染Leu90Phe突变型PTH细胞的培养基中的iPTH分泌水平(iPTH:402.3±16.7 vs.685.3±29.5pg/ml,P<0.05),但仍显著低于 WT。结论本研究报告了PTH基因的3个RVs,涉及两个转录本(NM_001316352和NM_000315)。1.成熟区的两种RVs(Va152Ile和Leu90Phe,NP_000306)会导致激素分泌能力受损,推测可能为致病性变异。2.长转录本中起始密码子的变异p.Gly2_Met5del(NP_001303281)不影响激素的分泌和蛋白表达,推测可能为非致病性变异。3.两种PTH罕见变异扩展了 FIH的致病变异谱。