研究背景根据WHO的数据显示,肺癌是发病率最高的癌症之一,并且是全球的主要死亡原因之一。目前小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)约占全球肺癌的15%,其恶性程度极高,预后不良。小细胞肺癌在治疗早期对化疗敏感,但极易出现化疗耐药,导致治疗失败。在临床治疗上,小细胞肺癌化疗耐药的问题亟待解决,因此,亟需阐明其分子机制寻找新的有效的治疗靶点。研究目的肝配蛋白A型受体2(EphA2)是受体型酪氨酸激酶,参与许多生物学过程,如细胞形态、黏附、运动、增殖、存活、分化等;并且其激酶活性对生物学行为产生重要影响。前期研究表明EphA2与小细胞肺癌耐药相关,通过免疫共沉淀、串联质谱技术寻找与EphA2结合的下游信号分子,发现PRMT1不仅与小细胞肺癌耐药性相关,还与野生型EphA2相关,但PRMT1与EphA2之间的作用机制仍然不清楚,P817H突变型EphA2对耐药性的影响依然不明确。本课题将进一步探索EphA2与PRMT1的分子作用机制,及它们在小细胞肺癌耐药调控中所起的作用,为后续开发EphA2-PRMT1通路的基因靶向治疗提供依据。研究方法及内容1.分别通过免疫印迹试验等分别在小细胞肺癌细胞株和临床样本中验证EphA2与小细胞肺癌耐药性之间的关系。2.在小细胞肺癌敏感株H69和H446中分别过表达野生型EphA2、A785S突变型EphA2、P817H突变型EphA2、Y930D突变型EphA2,在小细胞肺癌耐药株H69AR和H446DDP中下调EphA2的表达,通过CCK8、免疫印迹试验、肿瘤干细胞成球实验对比野生型EphA2和突变型EphA2对小细胞肺癌的耐药性和肿瘤干细胞干性的影响。3.通过免疫共沉淀、串联质谱寻找出EphA2相互作用的下游信号分子PRMT1。通过免疫印迹试验、CCK8、肿瘤干细胞成球实验、免疫共沉淀、GST pull down发现PRMT1与野生型EphA2直接结合增强肿瘤干细胞干性介导小细胞肺癌耐药。4.通过免疫共沉淀、质谱分析发现,PRMT1可以通过与SOX2结合,并催化SOX2的第43位精氨酸发生甲基化,增强肿瘤干细胞干性介导小细胞肺癌耐药。5.分别用EphA2抑制剂ALW-Ⅱ-41-27和PRMT1抑制剂AMI-1处理小细胞肺癌耐药株H69AR和H446DDP,明确抑制剂对小细胞deep genetic divergences肺癌肿瘤干细胞干性的影响,同时抑制剂联合化疗药使用,观察3-Methyladenine对小细胞肺癌耐药性的影响。研究结果1.EphA2与小细胞肺癌耐药性密切相关。2.野生型EphA2增强肿瘤干细胞干性促进小细胞肺癌耐药,P817H为功能缺失突变。3.EphA2通过PRMT1介导小细胞肺癌耐药。4.EphA2与PRMT1直接结合。5.PRMT1与SOX2结合,并催化SOX2发生甲基化。6.抑制剂ALW-Ⅱ-41-27在体内以及体外抑制小细胞肺癌生Ferrostatin-1体内实验剂量长。结论野生型EphA2与PRMT1直接结合,PRMT1结合并甲基化SOX2,通过增强肿瘤干细胞干性促进小细胞肺癌耐药;EphA2是介导小细胞肺癌耐药的重要调控基因。