糖基化作为最丰富的翻译后修饰,广泛影响着各类蛋白和脂质的功能。O-Glc NAcylation作为细胞核和细胞质蛋白上的一种独特的糖基化修饰和细胞转录、蛋白翻译等多项生理过程息息相关。OGT作为一种将O-Glc NAc添加到目的蛋白上的酶,在包括癌症、糖尿病、神经退行性疾病等多种疾病中异常表达。目前OGT的小分子抑制剂种类较为单一,选择性低,主要通过结合供体底物UDP-Glc NAc口袋从而抑制OGT活性,该过程可能会影响细胞内其他糖基化修饰。因此,寻找具有新结合模式的靶向OGT的小分子抑制剂成为了本课题的研究目标。本课题研究工作主要分为三个方面:一、HTRF高通量筛选方法的建立。通过构建、表达和纯化OGT,建立了基于OGT酶活功能的HTRF高通量筛选体系,并测试了体系的稳定性和可行性。二、OGT小分子抑制剂的筛选和确证。利用HTRF高通量筛选体系筛选了1966个化合物,确定了苗头化合物CDDO,IC_(50)=6.56±1.69μM。~1H-NMR和MST证明CDDO与OGT直接结合,K_d=1.7μM。HDX-MS证明CDDO结合在OGT的TPR域和N端结构域所形成的口袋中,酶活竞争实验验证了HDX-MS结果,证明OSMI-4的浓度变化不会影响CDDO的IC_(50)值。建立了Alpha Screen的方法来验证CDDO类似物对OGT的抑制LY2835219活性,最后使用分子对接预测CDDO及其类似物的结合模式。分子对接预测CDDO及其结构类似物的活性变化是由于和Leu492和Asn526形成了不同数量和距离的氢键。三、OGT结构解析。通过培养OGT-CDDO的共结晶蛋白来验证分子对接的预测结果。通过改善OGT纯化条件、空晶蛋白的池液条件和Soaking时间等方面提高晶体质量,最终得到了分辨率为3.8?的OGT蛋白空晶,后续将继续对晶体培养条件进行优化来分析CDDO和OGT的具体结合模式。在本课题中,通过高通量筛选发现和确证了靶向OGT的小分子抑制剂。现有的OGT抑制剂大部分结合在催化区域,CDDO被首次发现结合在TPR域和N端结构域的口袋中。CDDO及其类似物对OGT均有不同程度的抑制作用,且具有良好的改造前景。综上所述,本课题首次开发了基于OGT酶活功能的HTRF高通量筛选方法。发现并确证了具有新型结合位点的小分子抑制剂CDDO。最后pulmonary medicine运用计算机辅助药物设计,预测了CDDO的结合模式,此网站为后续OGT抑制剂的发现和改造奠定良好的基础。