饲用蛋白酶具有提高动物生产性能、保护肠道健康、降低饲料成本和减少污染物排放等功效。然而,目前在售的商业蛋白酶热稳定性较差,无法满足颗粒饲料制粒的生产需求,因此,迫切需要开发耐热型饲用selleck产品蛋白酶。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为芽孢杆菌科的模式生物,相对于其他表达系统具有独特优势,是蛋白酶理想的表达宿主菌。本论文探究了不同耐热蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达情况,并通过构建枯草芽孢杆菌表达工具箱,优化信号肽、强启动子等元件,进一步提高了耐热蛋白酶的表达;另外,利用理性设计手段提高了高活性蛋白酶的耐热性,获得了数款具有良好耐热性的饲用蛋白酶,为耐热饲用蛋白酶产品的开发奠定了基础;最后通过转录组和翻译组的联合分析揭示了枯草芽孢杆菌发酵过程中与外源蛋白(蛋白酶)高效表达高度相关的代谢通路,确定了关键差异表达基因,为今后利用基因工程手段对枯草芽孢杆菌高效表达外源蛋白的代谢工程改造提供了具有参考价值的理论依据,具体研究结果如下:(1)首先,通过对18条耐热蛋白酶基因的表达筛选,实现了4条耐热蛋白酶基因的组成型胞外分泌表达,蛋白酶1143、164、158和K19的胞外酶活分别为1059.95 U/m L、43.51 U/m L、14.54 U/m L和19.40 U/m L。进一步研究了这4种重组耐热蛋白酶的酶学性质:蛋白酶164为中性金属蛋白酶、158为弱碱性丝氨酸蛋白酶、1143和K19为嗜碱性蛋白酶,均表现出良好的化学试剂稳定性;其中蛋白酶164、158和K19的耐热性与28种已商业化蛋白酶产品相比,表现出较大的优越性,具有良好的商业应用潜力。进一步对中性金属蛋白酶164的热稳定性进行研究:结果表明金属离子Ca~(2+)和Mg~(2+)有利于提高其热稳定性,尤其是Ca~(2+)具有更显著的效果。10 m M Ca~(2+)和Mg~(2+)具有协同提高蛋白酶164热稳定性的作用,在80°C时,温度半衰期(t_(1/2))相对于野生型(7.42 min)提高了50.42倍。在金CP-690550 NMR属离子存在下,蛋白酶164具有耐受95℃高温的优异稳定性,且明显优于目前市售的蛋白酶产品。最后,通过结构分析揭示了金属离子Ca~(2+)和Mg~(2+)能够显著提高蛋白酶164热稳定性的机制:是由于氨基酸残基与金属离子之间的共价螯合和额外的静电相互作用,帮助提medical insurance高蛋白酶164二级结构的稳定性,从而显著提高其热稳定性。(2)为了实现蛋白酶1143和164胞外活性的提升,自建了一个包含有枯草芽孢杆菌244条信号肽(Signal peptide,SP)的工具箱片段库,并构建了含有强启动子(p Shuttle-09)的基础载体。通过构建枯草芽孢杆菌信号肽表达库,结合高通量筛选的方法,实现了蛋白酶1143从2000个克隆子中最佳信号肽(SP_(Bsl B))的筛选,含有该信号肽的表达宿主菌,胞外酶活较野生型提高了1.88倍,达3548.05±80.39 U/m L。此外,蛋白酶164从5000个克隆子中筛选到的最佳信号肽(SPXyn D),含有该信号肽的表达宿主菌,胞外酶活较野生型提高了5.15倍,达383.55±15.20 U/m L。通过对两种蛋白酶的筛选,验证了利用信号肽工具箱片段库提高蛋白酶活性或其他酶制剂活性的可行性。(3)为了提高蛋白酶1143(胞外活性最高)的耐热性,依据其晶体结构B-factor值的大小,确定了N18、S97～S101、E110和R143这8个突变位点。利用其与146条嗜热蛋白酶的多序列比对结果,确定了21个突变体,并通过枯草芽孢杆菌表达系统实现了这21个突变体的异源表达。其中15个突变体(N18L,S97A和S97H,S98R和S98E,S99L和S99A,G100E和G100A,S101G和S101V,E110L,R143V、R143L和R143G)在65℃下的t_(1/2)值较野生型提高了1.13～31.61倍。通过酶活和热稳定性加权评分的引入,确定了6个复合突变体。这6个复合突变体在65℃下的t_(1/2)值较野生型蛋白酶1143提高了2.12～10.05倍。其中复合突变体N18L/R143L/S97A、N18L/R143L/S99L和N18L/R143L/G100A的热稳定性提高了约4倍,具良好应用前景。结构分析揭示了复合突变体热稳定提高可能与结构的疏水性增加和柔韧性降低导致额外的疏水相互作用形成相关。(4)最后,为了进一步研究耐热蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达调控机制。首先,通过对蛋白酶1143和164枯草芽孢杆菌表达宿主菌的碳源和氮源的添加种类及其添加量,装液量、接种量、脱脂奶粉含量及发酵时间进行了单因素优化。研究发现,最优摇瓶发酵培养基为:乳糖1%、蛋白胨6%、氯化铵1%、脱脂奶粉0.8%、氯化钠0.5%、七水合硫酸镁0.5%和磷酸氢二钾0.5%,接种量5%、装液量16%,发酵时间需达到66 h以上,蛋白酶1143和164的胞外酶活达到了4687.93±191.03 U/m L和468.38±18.20 U/m L。以蛋白酶1143为报告菌株,进一步通过对报告菌株不同发酵时期的转录组和翻译组联合分析表明:在快速产酶期(发酵第12小时、48小时和60小时)显著性相关的差异基因有41个;并且这41个基因通过翻译组测序验证了在翻译水平也是差异表达的,显著性富集前10的pathway有9个Metabolism以及一个Membrane transport通路,涉及16个显著差异基因。另外,通过转录组分析表明:在产酶后期(发酵第48小时、60小时和72小时)显著性相关的差异基因有160个,显著性富集前10的pathway有9个Metabolism以及一个Immune system通路,涉及28个显著差异基因。此外,相同发酵时期转录组和翻译组联合分析表明,枯草芽孢杆菌在转录水平和翻译水平只有54.69%的差异基因是一致的。其中翻译水平上有436个差异基因是转录组无法揭示的,显著性富集前10的pathway有7个Metabolism、2个Cell motility以及一个Signal transduction通路,涉及47个显著差异基因。综上,枯草芽孢杆菌是以中心代谢途径(碳代谢和氮代谢)为主,其他代谢途径(次级代谢、有机化合物降解、电子传递链、双组分系统以及细菌运动)相辅的联合调控方式进行外源蛋白(蛋白酶1143)的表达调控。