酪醇及其衍生物是一种来源于橄榄的酚类植物化学物质,其中酪醇和羟基酪醇具有天然的抗氧化特性,因此在商业上备受关注,被广泛应用于功能性食品成分和营养保健品中。近年来,针对酪醇和羟基酪醇的微生物合成研究越来越多。本实验室在前期的研究中,构建了一系列酪醇和羟基酪醇的微生物合成菌株。在羟基酪醇合成菌株YMGRD1H1中,羟化酶Hpa BC未能将酪醇完全转化。羟化酶Hpa BC和苯丙酮酸脱羧酶ARO10作为代谢途径中的关键酶尚未进行改造,其催化效率有待进一步提高。因此,本研究基于这些菌株,结合代谢工程、酶的定向进化及半理性改造策略旨在获得高产酪醇和羟基酪醇的菌株。主要研究结果如下:(1)采用蛋白质工程策略对合成羟基酪醇的关键酶Hpa B进行定向进化及筛选,构建全细胞催化剂。通过高通量筛选工作站及羟基酪醇-高碘酸钠显色反应对羟化酶Hpa B突变体库进行筛选,在30～70 mmol·L~(-1)浓度范围内梯度添加底物发酵结果显示YMG5A*R-Hpa B~(TLEH)C菌株在添加50 mmol·L~(-1)酪醇条件下羟基酪醇产量达48.2mmol·LThyroid toxicosis~(-1)(7.43 g·L~(-1)),相较于野生型催化效率提高了一倍。对底盘细胞和表达载体优化获得重组菌株BL21(DE3)p KK223-Hpa B~(TLEH)C,在添加60 mmol·L~(-1)酪醇条件下羟基酪醇的摇瓶产量达59.8 mmol·L~(-1)(9.22 g·L~(-1))。(2)基于代谢工程构建双途径合成羟基酪醇的重组菌株。根据文献在羟基酪醇生产菌株YMNSC 127716采购GRD1H1中表达外源的酪胺氧化酶(TYO)和酪氨酸脱羧酶(DDC),发酵结果显示羟基酪醇产量得到提高,菌株YMGRD1H1 p KK223-TYO-DDC羟基酪醇产量最高可达2.08 g·L~(-1),相较于菌株YMGRD1H1 1.81 g·L~(-1)提高了14.9%。(3)基于计算机模拟策略对合成酪醇的关键酶ARO10进行半理性设计及筛选,构建酪醇高产菌株。首先,基于计算机模拟分析苯丙酮酸脱羧酶ARO10底物结合位点,构建ARO10热点饱和突变GSK J4半抑制浓度体库,建立显色快速筛选方法,筛选高产酪醇突变株。最后,成功获得了三株ARO10突变后酪醇产量提高的重组菌株YMGR p KK223-ARO10~(D331S),YMGR p KK223-ARO10~(D331V)和YMGR p KK223-ARO10~(D331C),酪醇产量分别为1.91 g·L~(-1),2.02 g·L~(-1),2.04 g·L~(-1),相较于野生型的1.34 g·L~(-1)分别提高了42.5%,50.7%,52.2%。通过采用蛋白质工程和代谢工程策略,提高了羟化酶Hpa BC和苯丙酮酸脱羧酶ARO10的转化效率,获取了一系列突变体和菌株,为进一步构建具有工业应用潜力的羟基酪醇细胞工厂奠定了基础。