Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)是宿主细胞响应病原体感染时合成和释放的一种细胞因子,它能诱导干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表达从而抑制病毒复制。抗病毒固有免疫在宿主抵御病毒感染中发挥重要作用,主要通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PR寻找更多Rs)识别病毒来源的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信号级联反应,启动IFN-Ⅰ免疫应答从而阻止病毒的入侵。然而,过度炎症激活会造成细胞因子风暴,导致机体损伤。因此,抗病毒天然免疫信号通路受到严格调控,泛素化修饰在其中扮演重要角色。TRIM蛋白家族作为E3泛素连接酶家族,能够以不同类型的连接方式对靶蛋白进行多聚泛素化修饰。鱼类TRIM家族既包括与哺乳动物同源的TRIM,也包括鱼类特有的TRIM(Fish novel tripartite motif,FTR)。目前,FTR在抗病毒天然免疫调控中的作用机制研究相对匮乏。本论文从鲤鱼中鉴定得到了一种鱼类特有的fin TRIM85(命名为CcFTR85),并对其调控IFN-Ⅰ表达的分子机制进行深入探究。我们从鲤鱼中克隆得到了CcFTR85基因的ORF(Open reading frame,ORF)区,其全长为1422 bp,编码474个氨基酸,预测蛋白分子量为54.2 k Da。系统进化分析显示,CcFTR85与FTR家族成员聚为一支,且与红鳍鲫(Carassius gibelio)FTR85的亲缘关系最近。首先,我们对CcFTR85在SVCV(Spring viremia of carp virus,SVCV)病毒感染和病毒类似物poly(I:C)、poly(d A:d T)selleck NMR刺激后的表达模式进行分析。q RT-PCR结果表明,SVCV刺激后CcFTR85在鲤鱼各免疫组织中的表达均上调;在外周血白细胞中,poly(I:C)和SVCV刺激后,CcFTR85的表达显著上调,而poly(d A:d T)刺激后,其表达没有显著性变化。表明CcFTR85参与RNA病毒感染免疫应答。病毒蚀斑实验和q RT-PCR表明,EPC细胞中过表达CcFTR85显著增强SVCV病毒复制。随后,我们对CcFTR85参与病毒感染促进病毒复制的机制进行了探讨。q RT-PCR及荧光素酶报告基因实验结果显示,CcFTR85可显著抑制poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ及其干扰素刺激基因(ISG15、PKR、Viperin)的表达,且呈现剂量依赖性。q RT-PCR与荧光素酶报告基因实验进一步表明,CcFTR85可以抑制RIG1、MDA5、c GAS、STING、TBK1、MAVS、IRF3及IRF7介导的IFN-Ⅰ、ISG15、PKR和Viperin的表达。为了确定CcFTR85的靶蛋白,我们进行了免疫共沉淀实验。结果显示,CcFTR85只与IRF3相互作用,而不与RIG1、MDA5、c GAS、STING、TBK1、MAVS和IRF7互作;随后,我们通过激光共聚焦显微镜观察发现,CcFTR85与IRF3共定位。病毒蚀斑实验和q RT-PCR实验进一步证明,CcFTR85减弱IRF3对SVCV病毒复制的抑制。我们又探究了CcFTR85调控IRF3的方式和机制。Western Blot实验表明,CcFTR85过表达能显著降解IRF3,且呈现剂量依赖性。放线菌酮追逐实验证明,CcFTR85加剧了IRF3及p-IRF3的不稳定性。Western Blot结果显示CcFTR85可显著抑制内源性IRF3及pIRF3的表达。非变性聚丙酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)结果表明,CcFTR85抑制IRF3二聚化。免疫荧光实验和Western Blot实验进一步证明,CcFTR85抑制p-IRF3入核。为了探究CcFTR85通过何种方式降解IRF3,我们进行了免疫共沉淀实验分析。结果表明,MG132处理后可以逆转CcFTR85对IRF3的降解,且CcFTR85显著增强IRFForensic Toxicology3的多聚泛素化修饰。为了确定CcFTR85对IRF3的泛素化修饰类型,将CcFTR85、IRF3与一组泛素突变体(K6、K11、K27和K48)共转染293T细胞,发现CcFTR85显著增强IRF3 K48位连接的泛素化。而将K48Ub突变为K48RUb时,CcFTR85对IRF3泛素化减弱。最后,我们对CcFTR85与IRF3互作的结构域进行了分析。我们分别构建了CcFTR85和IRF3不同结构域的缺失突变体,并进行了免疫共沉淀实验。结果表明CcFTR85通过其PRY-SPRY结构域与IRF3相互作用,IRF3通过其IAD结构域与CcFTR85相互作用。我们通过q RT-PCR和免疫共沉淀实验探究CcFTR85发挥负调控功能的结构域。结果表明,与全长CcFTR85相比,缺失RING结构域的CcFTR85对IRF3介导的IFN-Ⅰ表达的抑制作用消失,且显著削弱对IRF3的多聚泛素化修饰。本论文揭示了CcFTR85通过K48位泛素化修饰靶向降解IRF3负调控IFN-Ⅰ的抗病毒天然免疫反应的机制,为鱼类FTR在天然免疫调控中的作用机制提供新的见解。