目的:鹿血多肽(DBP)是以鹿血为原料,经过蛋白酶水解提取的多肽成分,中医临床预防及治疗方面得到了广泛的开发与利用。同时,多种疾病的发生发展与患者自身免疫力低下相关,调节自身免疫力对多种疾病的辅助治疗都是行之有效的途径。目前,对于鹿血多肽的免疫调节活性相关的深入研究较少。因此,本研究的目的是筛选免疫调节活性高的鹿血多肽的制备方法,并用RAW 264.7细胞以及环磷酰胺(CTX)致免疫抑制小鼠模型对其进行验证,从而揭示鹿血多肽在免疫调节方面的作用机制。方法:酶解法制备鹿血多肽,得到胃蛋白酶和胰蛋白酶两步酶解的鹿血多肽(PTDBP)、胃蛋白酶提取的鹿血多肽(PDBP)和胰蛋白酶提取的鹿血多肽(TDBP)。用比色法测定含量,Tricine-SDS-PAGE法测定分子量区间。通过细胞活力,吞噬活性和一氧化氮(NO)的分泌能力的检测,筛选并确定了具有免疫调节活性潜力的PTDBP。用体外抗氧化体系评价PTDBP、PDBP、TDBP的抗氧化能力。测定了PTDBP中氨基酸的组成及含量,评价PTDBP的营养价值。采用小鼠RAW 264.7巨噬细胞探究PTDBP的体外免疫调节作用,观察PTDBP对巨噬细胞的细胞活力,吞噬活性,NO的分泌能力,黏附能力,活性氧(ROS)分泌能力的影响。检测细胞因子TNF-α和IL-6的分泌情况,并检测RAW 264.7细胞的细胞周期。在基因水平上研究了PTDBP对i NOS、TNF-α和IL-6 m RNA的表达量的影响。基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,探讨PTDBP对RAW 264.7的免疫调节活性机制。建立CTX致免疫抑制小E7080体内鼠模型,以研究PTDBP的体内免疫调节活性。计算小鼠免疫器官指数,检测血象相关指标,测定免疫球蛋白和细胞因子的变化情况,并对小鼠免疫器官进行了HE染色。通过Western blot实验方法,探讨PTDBP是否激活MAPK信号通路以发挥体内免疫调节作用。通过正交试验,以腥味评定为指标,研究β-环糊精和酵母的最佳脱腥工艺。以稳定性系数为指标,筛选合适的稳定剂。以感官评定为指标,确定PTDBP口服液Cell Imagers的配方。最后,通过测定PTDBP口服液的理化指标,考察其稳定性。结果:成功制备了PTDBP、PDBP、TDBP,其中PTDBP的多肽含量最高。初步免疫调节活性研究表明,与PDBP和TDBP相比,PTDBP可以增强巨噬细胞的增殖作用,吞噬活性和NO分泌量,说明PTDBP具有最佳的免疫调节活性。PTDBP氨基酸分析结果表明,PTDBP中包含了18种氨基酸,其中含有7种必需氨基www.selleck.cn/products/wnt-c59-c59酸。PTDBP对DPPH·的IC_(50)值为4.061±0.288 mg/m L,对ABTS·的IC_(50)值为0.629±0.015mg/m L,对·OH的IC_(50)值为3.864±0.245 mg/m L,表明PTDBP有一定的自由基清除活性。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,PTDBP分子量小于7.8k Da。基于RAW 264.7巨噬细胞,研究了PTDBP的体外免疫调节活性。结果表明,PTDBP对细胞无明显毒性。125.0-500.0μg/m L PTDBP显著提高巨噬细胞的吞噬能力、黏附功能、NO、TNF-α、IL-6的分泌水平,还可以刺激巨噬细胞产生ROS。PTDBP通过作用于RAW 264.7细胞G0/G1期,达到促进细胞增殖的作用。PTDBP上调i NOS、TNF-α、IL-6m RNA表达水平,激活MAPK信号通路发挥免疫调节作用。建立CTX致小鼠免疫抑制模型,研究PTDBP的体内免疫调节活性。实验结果表明,经过PTDBP干预后,缓解了CTX造成的减重倾向,恢复了小鼠白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)等血细胞指标及骨髓有核细胞数(BMNC),并且促进了免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白Ig G和细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。同时,PTDBP提高免疫抑制小鼠的免疫器官指数,保护脾脏和胸腺的生长以及改善病理学变化。Western blot实验结果显示,不同浓度的PTDBP可以上调CTX诱导的免疫抑制小鼠脾脏MAPK信号通路中p38、JNK、ERK蛋白磷酸化水平,表明PTDBP激活MAPK信号通路发挥免疫调节作用。制备PTDBP口服液,4.0%β-环糊精和1.5%酵母作为脱腥剂,黄原胶0.07%、果胶0.06%、CMC-Na 0.06%为稳定剂,配方为PTDBP 0.5%,蔗糖4.98%,柠檬酸0.05%。PTDBP口服液感官良好。结论:本研究采用两步酶解法制备了PTDBP,研究表明PTDBP通过激活MAPK通路,提高体内和体外的免疫调节活性,为PTDBP作为免疫调节肽的综合利用与开发开辟新思路。