伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)在我国猪群中持续流行,是一种对养猪业危害巨大的病原。2011年biomimetic drug carriers,PRV变异株在我国出现,导致PRV在中国大面积爆发,给我国养猪业带来了巨大经济损失。已有研究证明黄酮类化selleck Regorafenib合物和咔唑类化合物具有广谱抗病毒活性。其中黄芩苷、槲皮素、橙皮苷、儿茶素等大量黄酮类化合物的抗病毒作用都有较为深入的研究。本研究在细胞水平评价了黄芩苷和咔唑类化合物这两类天然植物提取物抗PRV的生物活性,为PRV抗病毒药物的开发打下了基础。具体研究内容如下:(1)本研究首先制备了PRV US3和EP0的多克隆抗体,并用于后续试验。本研究在细胞水平评价了黄芩苷对PRV对细胞的毒性和抑制PRV复制的效率:用不同浓度的黄芩苷处理PK-15细胞,用CCkFerrostatin-1说明书-8试剂盒测得50%细胞毒性浓度(CC_(50))为152.9μM;在PRV感染的过程中添加不同浓度的黄芩苷,在感染后24 h测定PRV的毒价,结果显示黄芩苷能够显著抑制PRV的体外复制,并且呈现剂量依赖性;通过毒价的测定计算出黄芩苷的半数最小抑制浓度(IC_(50))为24.02μM,选择性指数SI=6.37。用Western Blot检测不同浓度的黄芩苷在感染PRV后6 h,9 h,12 h,24 h的PRV US3的表达量,结果显示,黄芩苷显著抑制PRV US3的表达,进一步证明黄芩苷的抗病毒活性具有剂量依赖性。有研究显示黄芩苷对病毒具有灭活作用。将PRV和黄芩苷(96μM)在37℃条件下孵育3小时,与DMSO对照组相比,黄芩苷使得PRV的毒价从(1.38±0.6)×10~8TCID_(50)/m L降低至(4.27±0.56)×10~7TCID_(50)/m L,说明黄芩苷对PRV有显著灭活作用。本研究进一步评价了不同加药时间对黄芩苷抗PRV作用的影响。首先,在对黄芩苷不同给药时间的考察中,用96μM黄芩苷提前处理PK-15细胞3 h或者6 h,再使用PRV感染细胞,与DMSO对照组比,提前处理细胞3 h或者6 h均能显著抑制PRV的复制。在延迟给药实验中,黄芩苷加药时间分别是感染后0 h,1 h,3 h,6 h,在PRV感染后24 h收样测定毒价,结果显示,感染后0 h,1 h和3 h加药能显著抑制PRV的复制,感染后1 h和3 h加药的抑制作用显著弱于感染后0 h加药,感染后6 h黄芩苷对PRV的复制无抑制作用。(2)本研究初步评价了咔唑类化合物对PRV的体外抑制的效果:检测18个咔唑类化合物对PRV的抑制效果和细胞毒性,结果显示No.4,No.10,No.16化合物对PRV的抑制效率均在80%以上,显著高于其他15个咔唑类化合物。这三个化合物(No.4,No.10,No.16)的半数细胞毒性浓度分别为33.12μM,62.42μM和42.98μM。在此基础上,我们进一步评价了No.4,No.10,No.16化合物对PRV的半数抑制浓度和选择指数,其IC_(50)分别为9.86μM,11.08μM和12.79μM,SI分别为3.36,5.63和3.36,结果显示这三个化合物均能有效抑制PRV的复制,且安全性良好,具有进一步开发的潜力。综上所述,本研究显示植物提取物黄芩苷和咔唑类化合物能够有效抑制PRV在体外的复制,并且证明黄芩苷抑制PRV复制存在多种机制——既能够直接灭活病毒,也能够在感染早期,通过调控宿主基因来抑制病毒复制。本研究为植物提取物中抗PRV活性物质的筛选和开发更新的信息和线索。未来,有必要对这两类药物在动物体内的有效性展开评估。