G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)数目众多,功能广泛,几乎参与生物体内所有生理活动的调控,其表达的异常和功能的失调会引发不同疾病,是令人瞩目的药物治疗靶点。GPCR超家族中,B2家族的黏附类G蛋白偶联受体(Adhesion GPCRs,a GPCRs)是成员数目第二多的亚家族,在多种生理过程及疾病的发生发展中都发挥着重要作用。a GPCR是一类结构与功能都很特殊的受体,拥有巨大的N端胞外区和经典七次跨膜螺旋结构,具有细胞黏附和信号转导的双重功能。a GPCR的N端胞外区富含黏附因子结构域,可以与细胞外的黏附分子发生相互作用来介导细胞–细胞间的信号交流,其跨膜区在受体激活后会发生构象变化并通过偶联不同信号蛋白来进行信号的跨膜转导。黏附因子结构域和跨膜区之间由一个保守的自剪切结构域连接,大部分a GPCR的自剪切结构域能自发水解断裂形成NTF(N-terminal fragment)和CTF(C-terminal fragment)两个蛋白片段。目前该家族中大部分成员仍是孤儿受体,其内源性配体未知,生理功能不明确,相关的激活机制研究也较少,严重制约了人们对该家族受体的了解,限制了其作为药物靶标的潜力。因此,从结构与功能角度来阐明该家族受体的激活机制、了解该类受体行使细胞黏附与信号转导BMS-354825分子量双重功能的分子机制,一直是该领域内重要的亟待解决的科学问题。本论文选取了多个具有代表性的a GPCR作为研究对象,并针对不同受体的自剪切能力、配体分子、下游G蛋白通路等特点展开结构与功能研究,主要包括生理状态下不能进行自剪切的ADGRA2受体和生理状态下能进行自剪切的ADGRE5、ADGRL3、ADGRF1、ADGRD1受体的激活机制研究;ADGRE5与CD55蛋白配体、ADGRL3与FLRT3蛋白配体的相互作用模式研究,以期更全面、更综合地了解a GPCR家族受体的激活机制,解释a GPCR胞外区蛋白配体对受体结构与功能调控的分子机理,认识不同a GPCR结构与功能上的共性与特性,弥补这方面研究的空白。在对a GPCR激活机制的研究中,本文对多个Bioactivity of flavonoids受体进行了系统的基因改造优化与表达纯化条件优化,成功获得了多个蛋白性质较理想的样品,并尝试运用X射线晶体衍射法或单颗粒冷冻电镜技术解析其非激活态结构;随后本研究还通过组装a GPCR–G蛋白复合物来稳定a GPCR的激活态构象,以解析其处于激活态的结构。经过长期探索,最终本文成功解析了激活态ADGRF1和ADGRD1与G蛋白复合物的结构,并开展了深入的功能研究。结合功能实验结果与结构数据分析,本文首次揭示了a GPCR家族受体独特的拴系短肽激活模式(Tethered-stalk peptide agonism)的分子机制,阐明了a GPCR上的短茎多肽与跨膜区的相互作用模式,并探讨了a GPCR自剪切能力对受体自激活过程的影响;同时,本文还比较了不同a GPCR受体在激活过程中关键基序的构象变化差异和G蛋白作用界面差异,体现了不同a GPCR在结构与功能上的特点;此外,本研究还利用质谱实验鉴定了对ADGRF1的激活具有调控作用的脂分子LPC(Lysophosphatidylcholine)的结构,并探索了前期文献中报道的小分子配体synaptamide在ADGRF1中的潜在结合位点。这些研究成果不仅拓展了对a GPCR激活机制的了解,也为后续相关的结构与功能研究打下了基础、指明了方向。在对a GPCR与胞外区蛋白配体复合物的结构研究中,本文对跨细胞呈递蛋白配体CD55和FLRT3进行了基因改造与表达纯化条件方面的优化,并获得了高质量的配体蛋白;随后本研究还探索了不同亚型的ADGRE5受体、不同表达纯化方法对ADGRE5–CD55蛋白复合物的影响,对复合物的组装做出了大量尝试;另外,本研究还对ADGRL3–FLRT3蛋白复合物进行了一系列优化,并成功获得了性质较佳的复合物样品进行电镜实验。这些研究工作在生化实验上对不同a GPCR–蛋白配体复合物进行了表征与验证,并为获得高质量复合物样品进行结构解析做出了大量探索,为揭示a GPCR胞外区蛋白配体调控受体功能的分Ferrostatin-1供应商子机制打下了基础。