目的:3-溴丙酮酸作为肿瘤细胞能量代谢抑制剂,具有高效广谱的抗肿瘤作用。但3-溴丙酮酸肿瘤内分布无特异性,具有严重毒副作用。课题拟通过酯化反应合Liraglutide体内成structured medication review3-溴丙酮酸-胆固醇酯p H响应性前药,通过考察其体内外抗肝癌作用及机制研究,探讨其对肝癌的抑制作用及机制,以期开发低毒高效的3-溴丙酮酸衍生药物。方法:1 3-溴丙酮酸-胆固醇酯的合成与表征通过酯化反应将胆固醇与3-溴丙酮酸相连接,制备化合物3-溴丙酮酸-胆固醇酯,对其结构进行确证。通过测定3-溴丙酮酸-胆固醇酯在酸性条件下的释放情况,考察其在肿瘤微环境中是否具有p H响应性。2 3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌细胞的抑制作用及机制探讨2.1 3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌细胞的抑制作用采用MTT法、Calcein-AM/PI染色法、集落克隆实验和划痕实验等方法检测药物对肝癌SMMC-7721细胞的增殖及迁移抑制作用。2.2 3-溴丙酮酸-胆固醇酯诱导肝癌细胞铁死亡作用研究MTT法检测铁死亡抑制剂能否阻断药物对肝癌细胞的抑制作用。利用流式细胞仪和荧光显微镜等技术检测药物诱导肝癌细胞脂质过氧化物(Lipid Peroxidation,LPO)产生情况;铁离子探针法检测3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌细胞内Fe~(2+)水平的影响。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)试剂盒测定3-溴丙酮酸对GSH的消耗能力。Western Blot检测3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌细胞内蛋白谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases 4,GPX4)和HK-II表达的影响。2.3 3-溴丙酮酸-胆固醇酯诱导肝癌细胞凋亡作用研究采用凋亡检测试剂盒、流式细胞仪、JC-1染色试剂盒和Western Blot考察3-溴丙酮酸-胆固醇酯进一步诱导肝癌细胞凋亡作用。3 3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌裸鼠移植模型的抑制作用及毒性作用研究建立人肝癌裸鼠移植模型,观察3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌移植模型生长的抑制作用及体内毒性作用,评价其体内对肝癌的抑制作用及安全性。结果:1课题通过酯化法成功合成了3-溴丙酮酸-胆固醇酯。FT-IR图谱、DSC图谱、~1H-NMR图谱均表明3-溴丙酮酸-胆固醇酯的成功制备。它能够响应肿瘤弱酸性的微环境,通过酯键的断裂,释放出糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸和脂质代谢产物胆固醇。2 3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有抑制肝癌细胞增殖与转移作用,机制涉及铁死亡诱导作用与凋亡诱导作用。2.1 3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有抑制肝癌细胞增值与转移作用MTT、Calcein-AM/PI染色、集落克隆和划痕等检测结果均表明3-溴丙酮酸-胆固醇酯对肝癌细胞的增殖与迁移具有较好的抑制作用。2.2 3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有诱导肝癌细胞铁死亡作用LPO实验显示3-溴丙酮酸-胆固醇酯能够增加肝癌细胞内LPO水平,使细胞内LPO积累。铁离子探针实验显示3-溴丙酮酸-胆固醇酯能使肝癌细胞内二价铁离子增加。GSH消耗结果显示,随着3-溴丙酮酸-胆固醇酯浓度增加,溶液颜色逐渐变浅,对GSH的消耗量逐渐增多。Western Blot结果显示随着3-溴丙酮酸-胆固醇酯浓度增加蛋白HK-Ⅱ与GPX4表达均明显降低。Fer-1作用后,HK-Ⅱ和GPX4表达有上调趋势。2.3 3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有诱导肝癌细胞凋亡作用流式细胞仪检测和JC-1染色实验表明3-溴丙酮酸-胆固醇酯作用后可引起更多的细胞凋亡。Western Blot结果显示3-溴丙酮酸-胆固醇酯作用于肝癌细胞后,随着3-溴丙酮酸-胆固醇酯浓度增加,Bcl-2表达有下调趋势,Bax表达有上调趋势。3 3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有抑制肝癌裸鼠移PLX4032配制植模型的生长的作用,且毒性小。体内实验表明,所制备的3-溴丙酮酸-胆固醇酯减缓肿瘤生长的效果更优,其能够诱导ROS产生,从而通过铁死亡和凋亡途径增强抑瘤效果。结论:3-溴丙酮酸-胆固醇酯可通过诱导肝癌细胞铁死亡与凋亡,抑制肝癌细胞的增殖与转移,发挥抗肝癌的作用,且由于其肿瘤组织酸性环境的特异性释药特性,具有毒性低、安全性高的特征。