4-叔丁基苯酚(4-tert-butylphenol,4-t BP)是一种广泛用于农业和工业的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)。4-t BP具有中度生物蓄积性、环境持久性和长期毒性的特点。通过食物链的生物放大效应,4-t BP在鱼类等动物体内高浓度富集,威胁水生动物的健康,如引起代谢性疾病。肝胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是一种复杂的代谢性疾病,与长期暴露于EDCs密切相关。然而,4-t BP是否能诱导肝IR尚不清楚。目前IR被发现与环境污染物诱导的多种细胞生物学途径密切相关,如自噬、细胞钙稳态、和细胞铁死亡。Micro RNA(mi RNA)是肝IR的关键调节因子,也是环境EDCs造成机体损伤的潜在中介因子。在此,本研究建立体内鲤鱼4-t BP暴露模型和体外鲤鱼原代肝细胞,鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),及草鱼肝细胞系(grass carp hepatocyte line,L8824)的4-t BP暴露模型。应用组织/细胞染色法、透射电子显微镜、转录组学检测技术、双荧光素酶报告基因检测法、细胞转染技术、实时荧光定量PCR技术、Western blot法、免疫荧光技术、及流式细胞术,检测了肝-体指数(hepatosomatic index,HSI)、血清生化指标、肝脏组织形态学变化、mi RNA和m RNA表达谱、坏死细胞数量及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平,构建了mi RNA-m RNA调控网络并进行验证、筛选与检测了肝IR、自噬、钙稳态和铁死亡相关信号转导通路。本研究旨在探索mi RNA-m RNA调控网络是否参与以及调控4-t BP诱导的肝毒性,为4-t BP毒理学研究提供科学依据。同时为IR相关疾病提供可能的预防和治疗靶点,为动物健康养殖提供环境决策依据。主要研究结果如下:(1)4-t BP暴露60天后引起鲤鱼HSI显著增加,提示4-t BP暴露引起鲤鱼肝代谢异常。(2)鲤鱼血清/肝脏生化指标的检测结果显示,4-t BP暴露引起反应肝损伤的血清指标(ALT、AST、LDH和GGT)显著提高,提示4-t BP暴露诱导鲤鱼肝损伤。另外,4-t BP引起IR的血清生化指标FBG和ABT-199核磁FINS水平以及HOMA-IR和HOMA-ISI值的异常,提示4-t BP暴露诱导鲤鱼IR。并且血清和肝脏中脂质生化指标显示,暴露于4-t BP后,TC、TG和LDL-C的水平明显升高,而HDL-C显著降低,该结果进一步为4-t BP暴露诱导鲤鱼肝IR提供了证据。(3)组织病理学观察结果显示,4-t BP暴露后破坏了鲤鱼的肝脏组织形态。另外,在4-t BP暴露的肝组织PAS染色图谱及油红O染色图谱中发现了肝IR的标志性变化,即肝糖原合成减少和肝脏脂质累积。透射电子显微镜下,4-t BP暴露后的肝细胞出现了铁死亡的标志性特征,提示4-t BP诱导肝脏组织损伤,可能与肝IR和细胞铁死亡密切相关。(4)通过筛选与分析mi RNA和m RNA的表达谱,发现70个差异表达mi RNAs和1484个差异表达的m RNAs(符合|log_2fold change|>1和P<0.05)参与了4-t BP诱导的鲤鱼肝毒性的分子机理。其中mi R-363是差异表达最显著的mi RNA,且与IR密切相关。并且对这1481个差异表达的m RNAs进行GO富集分析和KEGG富集分析发现铁死亡、氧化应激、自噬、钙信号以及IR可能参与了4-t BP诱导的鲤鱼肝毒性。(5)使用mi Randa软件预测mi R-363的潜在靶m RNA,结合m RNA测序结果筛选与mi R-363表达趋势相反(即显著上调)的潜在靶m RNA。筛选结果显示PKCδ和CACNA1D可能是mi R-363的靶基因。双荧光素酶报告基因检测及体外细胞转染试验进一步验证了mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴的存在。(6)根据KEGG富集分析结果和其他研究者的报道,PKCδ和CACNA1D与肝IR密切相关。q RT-PCR技术检测发现4-t BP引起mi R-363表达的下降伴随着PKCδ和CACNA1D表达升高,以及肝IR相关的差异表达的m RNAs(包括TNF-α、TNFR1、IL-6、m TOR、RPS6K和IRS1)的表达水平的变化,提示4-t BP诱导了鲤鱼肝IR。此外,mi R-363的抑制和4-t BP暴露均会损伤肝糖原的合成,而过表达mi R-363可缓解4-t BP诱导的肝糖原合成受损。并且4-t BP与mi R-363 mimic联合处理可以显著改善独立的4-t BP暴露引起的上述肝IR相关因子的表达变化。进一步地,PKCδ特异性抑制剂粗糠柴苦素(rottlerin,Rot)的预处理、以及si RNA PKCδ和si RNA CACNA1D的转染处理均显著逆转了mi R-363 inhibitor导致的IL-6、IRS1、m TOR和RPS6K的m RNA表达的变化。研究结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴参与了4-t BP诱导的肝IR。(7)q RT-PCR技术和Western blot法结果显示4-t BP暴露引起Calpain2和p62的表达显著增加,而ATG7,ATG5,和LC3b的表达显著降低,提示4-t BP诱导了鲤鱼肝脏自噬受损。自噬标志因子(LC3b和p62)的免疫荧光染色显示,mi R-363 mimic预处理后显著缓解了4-t BP刺激导致的LC3b的荧光强度降低和p62的荧光强度增加。过表达mi R-363可以显著改善4-t BP暴露引起的上述自噬相关因子的表达变化。并且,mi R-363 inhibitor显著降低了LC3b的荧光强度,增加了Calpain2和p62的m RNA表达,降低了ATG7、ATG5和LC3b的m RNA表达,这与4-t BP暴露引起的趋势一致。有趣的是,Rot的预处理、以及si RNA PKCδ和si RNA CACNA1D的转染处理均显著逆转了mi R-363 inhibitor导致的上述变化。结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴参与了4-t BP诱导的自噬受损。(8)暴露于4-t BP导致Ca~(2+)信号相关的DEGs(包括CALM2和CAMKII)的表达水平显著增加及Ca~(2+)的荧光强度显著升高。而mi R-363 mimic预处理显著缓解了4-t BP引起的CALM2和CAMKII表达水平的增加和Ca~(2+)的荧光强度的升高。另外,mi R-363 inhibitor显著增加了CALM2和CAMKII的表达水平,以及Ca~(2+)的荧光强度。有趣的是,Rot的预处理、以及si RNA PKCδ和si RNA CACNA1D的转染处理均显著缓解了mi R-363 inhibitor导致的上述变化。研究结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴参与了4-t BP诱导的Navitoclax半抑制浓度细胞钙超载。(9)自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)和钙通道阻滞剂硝苯地平(nifedipine,Nif)的添加均显著逆转了4-t BP引起的IR相关基因的表达变化(TNF-α、TNFR1、IL-6、m TOR和RPS6K的表达水平的显著增加,和IRS1的表达显著下降)通过激活自噬和抑制Ca~(2+)通道,这与mi R-363 mimic的效应相一致。结果表明4-t BP通过自噬受损和Ca~(2+)超载诱导了肝IR。(10)根据获得的GO和KEGG富集分析显示,6个差异表达的m RNAs(HSPA5、ATF4、SLC7A11、GCLC、GSS和GPX4)与细胞铁死亡相关。此外,应用流式细胞术和AO/EB染色发现细胞坏死率随4-t BP浓度的升高而明显增加。透射电子显微镜观察L8824细胞发现细胞铁死亡的标志性特征,4-t BP暴露后的肝细胞的线粒体皱缩,线粒体嵴减少,线粒体膜密度增加,这与体内试验的发现一致。并且,4-t BP暴露后导致肝细胞的MMP显著降低,铁死亡相关DEGs(HSPA5、ATF4、SLC7A11、GCLC、GSS和GPX4)的表达水平显著下降。有趣的是,铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)预处理缓解了4-t BP引起的上述趋势,提示4-t BP诱导了肝细胞铁死亡。(11)KEGG和GO富集分析显示,4个差异表达的m RNAs(NCOA4、FTH1、STEAP3和SLC40A1)与铁稳态相关。暴露于4-t BP后,NCOA4和STEAP3的m RNA和蛋白水平均显著升高,而FTH1和SLC40A1的m RNA水平显著降低。另外,4-t BP暴露后,鲤鱼肝组织的总铁含量也显著提高了58.9%。在体外试验中,4-t BP组也表现出与体内试验相同的趋势,有趣的是,Fer-1预处理缓解了4-t BP引起的上述趋势。提示4-t BP诱导肝细胞铁超载,与细胞铁死亡密切相关。(12)试验发现,暴露4-t BP后鲤鱼肝组织的抗氧化酶(SOD、CAT、GPX、GSH和GST)的活性显著降低,说明4-t BP降低鲤鱼肝脏的抗氧化能力。暴露4-t BP引起H_2O_2和MDA水平显著升高,说明4-t BP导致鲤鱼肝脏组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)过度累积和脂质过氧化水平升高。并且,4-t BP诱导鲤鱼肝组织的NO和i NOS活性明显升高,说明4-t BP导致鲤鱼肝脏组织清除活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的能力下降。此外,在鲤鱼原代肝细胞中,4-t BP组GPX1、SOD1、CAT、OXR1b和PRDX1水平较对照组显著降低,而ROS水平显著升高。有趣的是,Fer-1预处理后显著缓解了4-t BP诱导的上述变化。上述结果表明4-t BP诱导了鲤鱼肝氧化应激,且与细胞铁死亡密切相关。综上所述,长期暴露于4-t BP会导致鲤鱼HSI升高,血清生化指标异常,提示鲤鱼肝脏损伤。进一步发现4-t BP诱导肝IR、自噬受损和钙超载的发生。在体外,我们进一步证明了4-t BP诱导的上述变化与mi R-363的减少有关。首次验证了mi R-363与PKCδ以及mi R-363与CACNA1D之间的靶向关系。此外,mi R-363 mimic通过抑制PKCδ和CACNA1D缓解了4-t BP诱导的自噬受损、钙超载和肝IR。特异性抑制PKCδ和CACNA1D可缓解mi R-363inhibitor引起的自噬受损、钙超载和肝IR。自噬的激活和Ca~(2+)通道的抑制被发现可以改善4-t BP诱导的肝IR。我们的上述研究结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴通过自噬受损和钙超载参与了4-t BP诱导的肝IR。此Abortive phage infection外,铁死亡是肝IR的诱因之一。本研究发现细胞铁死亡也参与了4-t BP诱导的肝损伤机制,并且Fer-1缓解了诱导肝IR的相关因素(GPX4的下降、铁超载和氧化应激),提示细胞铁死亡可能也参与了4-t BP诱导的肝IR。总之,本研究结果不仅为4-t BP毒理学研究提供了科学依据,为动物健康养殖提供环境决策依据。