4-羟基香豆素是合成抗凝血药物华法林的前体,目前主要通过化学合成法生产,存在安全性差、能耗高等问题。以葡萄糖等为原料生物合成4-羟基香豆素具有绿色可持续等优势,但由于合成途径中前体供应不足、产物细胞毒性大,限制了其高效生物合成。本文以大肠杆菌为底盘菌株,通过增强莽草酸途径、富集丙二酰辅酶A、菌株适应性实验室进化等方法构建了高效合成4-羟基香豆素的菌株,具体结果如下:为增强莽草酸途径通量、增加PEP和E4P供应,采用CRISPR/Cas9基因编辑等方法过表达基因pps A、tkt A、aro G~(fbr)和aro L,4-羟基香豆素产量达到了596.72 mg/L。进一步敲除大肠杆菌内源硫脂酶基因ydi I,减少水杨酰辅酶A降解,4-羟基香豆素产量提高到809.84 mg/L。为增加丙二酰辅酶A供应,采用基因敲除或启动子替换的策略抑制脂肪酸合成。将selleckchem Tofacitinib关键致死基因簇fab D/H/G的启动子替换为稳定期启动子P_(flgc),丙二酰辅酶A的含量提高了27.27%,4-羟基香豆素量达到913.25mg/L;敲除了关键非致死基因fab F,丙二酰辅酶A含量提升40Belnacasan研究购买.91%,4-羟基香豆素产量达到1117.96 mg/L。为解决4-羟基香豆素的细胞毒性问题,对大肠杆菌菌株进行了适应性实验室进化,获得可耐受7 g/L 4-羟基香豆素的菌株JRX00。对JRX00和亲本菌株进行全基因组测序,获得14个差异突变基因。通过在亲本菌株对差异基因过表达和敲除,筛选出yja A和kat E两个单靶点有效基因。敲除kat E,工程菌株4-羟基香豆素产量达到1249.54 mg/L,为目前生物合成Improved biomass cookstoves4-羟基香豆素的最高产量。本研究构建了高效合成4-羟基香豆素的大肠杆菌工程菌株,为其绿色可持续生产奠定了基础;获得了4-羟基香豆素耐受的靶点基因,为解析其毒性机理提供了方向和理论支持。