研究目的:目前,每年的全球外科手术量已达3.13亿人次,但其中至少有420万人在术后30天内发生死亡,术后死亡人数占全球死亡人数的7.7%。究其原因,术后感染是导致术后患者死亡的主要原因。术后感染的发生不仅延长了患者住院天数,增加了全球医疗卫生负担,还会导致机体免疫功能状态受到抑制,进而增加患者术后脓毒症易感性,影响疾病转归。脓毒症被定义为机体对感染的反应失调而导致危及生命的多器官功能障碍,而机体免疫功能障碍是脓毒症的核心演变机制。已有研究表明,单核/巨噬细PLX3397胞吞噬功能障碍是术后机体免疫功能障碍的重要特征,可以显著降低宿主清除病原菌的能力,从而增加术后感染和术后脓毒症的发生,其中单核/巨噬细胞极化状态是影响单核/巨噬细胞吞噬能力的关键原因。有研究报道,单核/巨噬细胞的极化和吞噬功能之间有着密不可分的关系。既往关于手术应激降低机体免疫功能进而增加脓毒症易感性的机制研究主要围绕中性粒细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞等展开,手术创伤后单核/巨噬细胞变化增加术后脓毒症易感性的分子机制的研究较少。激肽释放酶相关肽酶8(kallikrein-related peptidase8,KLK8),也称Neuropsin,属于丝氨酸蛋白酶家族,是一种具有水解细胞外基质或细胞膜表面蛋白等底物蛋白功能的分泌型丝氨酸蛋白酶,具有组织重构及进行细胞功能调节等重要生物学效应。既往有研究报道,KLK8参与机体先天性和适应性免疫应答过程,KLK8可诱导PI3K/Akt/m TOR和Notch通路的激活,而PI3K/Akt/m TOR和Notch信号通路在单核/巨噬细胞中发挥重要作用。因此,本研究主要围绕KLK8探讨了单核/巨噬细胞在手术创Gefitinib-based PROTAC 3试剂伤增加脓毒症易感性中的作用机制,期望为术后免疫抑制障碍提供一个新的防治靶点。研究方法:本研究首先建立小鼠手术应激模型观察手术创伤对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,采用腹腔注射大肠杆菌(Escherichia coli,E.Coli)的方法建立腹腔感染模型观察手术创伤是否会增加脓毒症易感性;接着,收取20例来自结直肠癌根治术后患者的外周血临床样本进行流式分析观察手术创伤后单/核巨噬细胞极化状态和吞噬功能的变化,收取小鼠手术应激模型后的肺、肝和肾组织样本进行定量PCR观察M1和M2指标的变化,并通过在RAW264.7细胞系上进行巨噬细胞M1和M2表型诱导后流式分析术观察其吞噬功能的变化;随之,为探讨术后巨噬细胞M2极化机制,通过NCBI数据库中有关巨噬细胞极化的基因芯片数据并采用定量PCR进行验证KLK8,后续研究聚焦在KLK8与巨噬细胞极化变化机制上;进一步在细胞学水平和动物水平通过采用定量PCR、ELISA及流式细胞术验证KLK8在手术应激后对单核/巨噬细胞极化和吞噬的影响;运用蛋白质谱检测、免疫共沉淀技术对KLK8可以作用的潜在底物进行筛选。最后,采用CD44激动剂在体外细胞学实验和体内整体动物学实验上观察KLK8与CD44如何相互作用影响手术后单核巨噬细极化和吞噬功能变化。研究结果:1.腹腔巨噬细胞流式分析结果发现:与术前相比,小鼠手术应激术后第一天和术后第三天腹腔巨噬细胞吞噬功能明显下降;与对照组相比,手术创伤腹腔感染可显著增加腹腔注射E.coil后的小鼠的死亡率和腹部细菌负荷;2.外周血临床样本流式分析结果表明,与术前相比,接受结直肠癌根治术后患者外周血单核/巨噬细胞吞噬能力在术后即刻开始下降,术后第一天和第三天下降显著;单核/巨噬细胞M1极化标志物CD86术后即刻开始增高,术后1天达到高峰,术后3天则恢复到正常水平,而单核/巨噬细胞M2极化标志物CD206随着术后时间的增加逐渐增多;遭受手术应激后的小鼠肺、肝和肾组织定量PCR监测M1和M2极化结果与外周血单核/巨噬细胞极化结果一致;定量PCR结果显示,与对照组相比,LPS诱导的巨噬细胞M1表型后其吞噬功能增强,而IL4诱导成为M2表型后,巨噬细胞吞噬功能下降;3.对NCBI基因芯片库跟巨噬细胞极化有关的4组基因芯片数据进行了生物学信息分析,结果显示,与M0相比,有31个基因在巨噬细胞M2极化中增高;随后,IL4诱导的M2型巨噬细胞定量PCR发现,与M0相比,M2型巨噬细胞中KLK8、BATF3和SMAP2基因的reconstructive medicinem RNA表达显著上调;si RNA敲低了RAW264.7细胞KLK8,BATF3,SMAP2的表达,定量PCR发现只有KLK8敲低能够阻断IL4诱导的巨噬细胞M2极化变化,故后续重点聚焦在KLK8在巨噬细胞M2极化中的作用机制。4.ELISA检测结直肠癌根治术患者的血浆发现KLK8在手术应激三天后表达明显上升;成功过表达KLK8的RAW264.7细胞,流式分析显示其吞噬功能显著下降;KLK8基因敲除小鼠的流式分析结果显示,KLK8 KO小鼠接受手术应激后吞噬功能明显增强;同时,与对照组相比,KLK8 KO显著降低了小鼠剖腹图探查术后的腹部细菌负荷量,生存率明显增高。5.蛋白质组学和免疫共沉淀技术得到KLK8与CD44之间存在相互作用的关系;无论体外细胞学和体内动物实验都显示,CD44激动剂A6可显著逆转过表达KLK8以及手术创伤刺激后KLK8高表达所带来的巨噬细胞M2极化和吞噬功能降低的现象。研究结论:1.手术创伤应激刺激可引起单核/巨噬细胞向M2极化并抑制单核/巨噬细胞吞噬功能,显著增加了术后感染及脓毒症的易感性;2.通过剪切CD44,KLK8介导手术应激后单核巨噬细胞M2极化,增加了术后感染及脓毒症易感性,KLK8/CD44有望成为术后感染及脓毒症防治的一个新的靶点。