研究背景:镉(Cadmium,Cd)是一种广泛应用于化工、电镀和核工业等领域的重金属,是一类对人和动物具有毒性的环境污染物。在工业生产过程中,Cd可通过废水废气等介质释放到环境中,主要通过呼吸道和消化道暴露进入人体,并且进入体内的Cd排出缓慢,生物半衰期可达10-30年,极易在体内器官中蓄积。因此,除了职业暴露人群,普通人群也可以通过多种途径接触Cd,进而引起健康危害。Cd暴露已被证明与多种肿瘤的发生风险高度相关,包括肺癌、前列腺癌和肾癌等,因此,国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)已将其列为I类ICI 46474核磁致癌物。深入的研究发现,细胞自噬在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用,是Cd暴露诱导肿瘤发生的潜在分子机制。研究表明,Cd暴露与乳腺癌发生发展也密切相关,然而细胞自噬在其中是否也扮演同样重要的角色目前还尚不清楚。因此,我们提出科学假设:Cd暴露可能通过调控自噬促进乳腺癌侵袭和转移。雷帕霉素是一种应用广泛的抗癌药物,包括用于治疗乳腺癌,然而雷帕霉素对Cd暴露诱导的乳腺癌进程的影响及其机制尚未揭示清楚。因此,本研究在明确Cd暴露可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭效应的基础上,研究细胞自噬在Cd促进乳腺癌细胞增殖和转移的作用及机制,同时研究雷帕霉素是否能拮抗Cd介导的乳腺癌增殖、迁移和侵袭效应及其作用机制。并进一步在乳腺癌人群样本上验证自噬相关蛋白的表达水平与临床相关性。研究内容:1.Cd通过抑制自噬促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭采用0、0.1、1、10μM Cd Cl_2处理人源乳腺癌细胞系MCF-7和T47-D细胞72 h建立Cd暴露模型,利用CCK-8实验、transwell-migration及transwell-invasion实验明确Cd暴露显著促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭效应。监测自噬的各个阶段发现,经Cd处理后的细胞GFP-LC3绿色荧光斑点数量明显降低,提示Cd暴露抑制自噬小体形成;然而Cd暴露后GFP-LC3与Lyso-tracker的共定位情况没有显著变化,溶酶体功能也无明显改变,提示Cd暴露既不影响自噬小体-溶酶体融合也不影响溶酶体降解功能。进一步检测自噬小体形成相关基因和蛋白的表达,发现Cd抑制ATG5的表达,提示Cd抑制的自噬是由ATG5介导的;过表达ATG5可逆转Cd对自噬小体形成的抑制,且拮抗Cd暴露促进的乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。这些结果表明Cd通过抑制ATG5表达而抑制自Biomechanics Level of evidence噬,从而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。2.ACSS2表达下调是Cd抑制自噬的潜在分子机制通过GSEA分析发现ACSS2高表达与ATG5基因成正相关,Gene MANIA数据库预测发现ACSS2与ATG5存在相互作用关系,表明ACSS2可能是调控Cd促癌作用的潜在靶点。Cd处理显著减少ACSS2的表达,过表达ACSS2能显著抑制Cd导致的乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的增加。同时过表达ACSS2可显著拮抗Cd抑制的自噬小体形成,以及ATG5表达的下降。通过Cistrome数据库分析发现ATG5启动子的表观遗传调控主要依此网站赖于H3K27乙酰化,检测H3K27乙酰化水平发现Cd暴露下调乳腺癌细胞H3K27的乙酰化水平,而过表达ACSS2可拮抗Cd处理导致H3K27乙酰化水平的下降。3.雷帕霉素通过激活ACSS2拮抗Cd诱导的乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭用CCK-8、transwell-migration与transwell-invasion等实验明确雷帕霉素抑制Cd诱导的乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭作用。此外,SPR实验证实了雷帕霉素直接与ACSS2蛋白结合,分子对接实验显示雷帕霉素直接结合于ACSS2蛋白的COA位点,表明ACSS2是雷帕霉素的直接结合蛋白;经ACSS2抑制剂处理后,雷帕霉素的拮抗作用消失。这些结果共同证实,雷帕霉素通过直接结合并激活ACSS2信号从而拮抗Cd介导的乳腺癌进展。4.ACSS2及ATG5表达水平与乳腺癌不良预后存在关联通过GEPIA和TCGA数据库获取ACSS2在乳腺癌组织和正常组织中的表达水平;利用Kaplan-Meier plotter数据库分析ACSS2的表达水平与乳腺癌患者预后的关联。通过q-PCR与免疫组化检测纤维瘤和乳腺癌病人组织中ACSS2及ATG5的表达水平。结果表明ACSS2与ATG5在纤维瘤病人组织中m RNA和蛋白表达明显高于乳腺癌组织,且二者的表达成正相关;低表达ACSS2和ATG5提示不良预后,表现为ACSS2高表达的乳腺癌患者其DFS明显长于ACSS2低表达的患者,且ACSS2和ATG5的表达与肿瘤大小呈负相关。研究结论:Cd通过抑制ACSS2的表达调控自噬相关基因ATG5的表达,进而抑制自噬小体的形成,从而促进乳腺癌的发展;雷帕霉素通过直接结合并激活ACSS2信号拮抗Cd介导的乳腺癌进展。我们的研究结果,从分子水平揭示了重金属暴露促乳腺癌效应的风险,从细胞自噬调控的崭新角度解析了重金属镉暴露促乳腺癌效应的分子事件,发现了雷帕霉素拮抗镉暴露促乳腺癌效应的分子靶标。