研究目的:肩袖损伤(rotator cuff injury)是常见的运动创伤,可造成肩Liproxstatin-1关节疼痛和活动受限,严重影响了患者的日常生活和运动能力。肩袖损伤常伴随着肩袖肌的退行性病变,包括肌肉萎缩(muscle atrophy)、脂肪浸润(fatty infiltration,FI)和纤维化(fibrosis),这也是决定患者临床结果的关键因素。研究发现,在肩袖损伤的病理变化过程中常伴随着低氧损伤,低氧也是肌腱病(tendinopathy)早期的关键调节因素。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是哺乳动物产生缺氧反应的关键调节因子,它是由一个独特的氧依赖性α亚基和一个β亚基组成的异二聚体。哺乳动物的HIFα具有三种同工型,即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。研究表明HIFα可以参与到脂肪分化的调节中,其中HIF-1α是脂肪生成的负调节因子,HIF-2α则为正调节因子。目前尚不清楚肩袖撕裂后肩袖肌的缺氧情况及其与肌肉退行性病变的关系。因此本研究旨在通过建立小鼠肩袖损伤模型,明确肩袖损伤后肩袖肌中的缺氧情况及可能形成原因,为损伤后肌肉退行性病变的治疗提供实验依据。研究方法:实验选取30只3月龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为2大组,每组15只,分别建立两种小鼠肩袖损伤模型,即单侧冈上肌(supraspinatus,SS)肌腱和肩胛上神经横断术(tendon transection and suprascapular nerve transection,TTDN),以及单侧冈上肌腱横断术(tendon transection,TT);每组根据不同的损伤时间点分为术后1周组(1wk)、术后2周组(2wks)和术后6周组(6wks),每组5只,对侧冈上肌为假手术对照组(Sham),即按上述方法暴露肩袖和肩胛上神经,不进行离断,随后闭合肌肉和皮肤。所有手术均在全身麻醉条件下进行(1%-5%异氟烷)。在术后1周、2周和6周的不同时间点取小鼠双侧冈上肌,制作冰冻切片。采用油红O染色(Oil Red O)观察肌肉脂肪浸润程度,通过CD31和laminin免疫荧光双染色,并计算CD31+细胞/肌纤维数量百分比测定肌肉血管密度,以及统计肌纤维横截面积(cross-sectional area,CSA)测定肌肉萎缩程度,Western Blot观察肌肉中低氧诱导因子(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)的蛋白表达水平。双因素方差分析(Two-Way ANOVA)检验各组间的差异,P<0.05具有显著性差异。研究结果:组织学观察发现在两种不同的肩袖损伤模型中,损伤侧冈上肌中出现大量脂滴聚积,其fat index(%)均较Sham侧冈上肌相比有显著升高(P<0.05),说明肩袖损伤后肩袖肌有明显脂肪浸润发生;肌纤维的排列出现紊乱,且通过对CSA进行统计后发现,在TT肩袖损伤模型中,损伤侧冈上肌的CSA较Sham侧相比,在术后2周和6周出现显著性减小(P<0.05);在TTDN肩袖损伤模型中,损伤侧冈上肌的CSA较Sham侧肌肉在各个术后时间点均出现显著性降低(P<0.05),这提示冈上肌在肩袖损伤后出现了明显的肌肉萎缩。接下来进一步通过对血管内皮细胞的标志物CD31的进行免疫荧光染色以观测血管密度。结果显示,在TT肩袖损伤模型中,损伤侧冈上肌中CD31+细胞/肌纤维数量百分比在损伤后各时间点均较Sham侧冈上肌显著降低(P<0.05),且该比值在损伤侧冈上肌中随着时间的延长显著升高(1wk vs 2wks:P<0.05;1wk vs6wks:P<0.01);在TTDN肩袖损伤模型中,与Sham侧冈上肌相比,CD31+细胞/肌纤维数量百分比在术后2周(P<0.01)和immune therapy术后6周时间点(P<0.05)均出现显著性降低。冈上肌血管密度在肩袖损伤后出现明显降低,意味着损伤部位的血流供应受到限制,这可能是造成肩袖肌缺氧的因素之一。随后通过Western Blot实验观察到,在TT肩袖损伤模型中,冈上肌中HIF-1α的蛋白含量在术后1周较Sham侧肌肉有明显升高(P<0.01),而在术后2周和6周时间点无明显变化(P>0.05),且术后2周损伤侧冈上肌的HIF-1α蛋白水平较术后1周损伤侧冈上肌相比出现显著下调(P<0.01)。HIF-2α和HIF-3α的蛋白表达在术后1周与HIF-1α的蛋白表达趋势相同,均出现显著升高(P<0.01)。损伤侧肌肉中HIF-2α的蛋白水平在术后2周和6周均较术后1周有显著降低(P<0.01),HIF-2α的蛋白水平随着时间的延长出现降低。而与HIF-1α和HIF-2α的蛋白表达不同的是,损伤侧肌肉中HIF-3α的含量在术后6周与Sham侧相比,出现显著上调(P<0.01);而在TTDN肩袖损伤模型中,冈上肌中HIF-1α的蛋白表达在术后1周和2周时间点较Sham侧冈上肌明显降低(P<0.01),但在术后6周无明显变化。与HIF-1α的变化相反,HIF-2α蛋白水平PI3K/Akt/mTOR抑制剂在术后1周和2周表现出显著升高(P<0.01)。冈上肌HIF-3α的蛋白表达在术后1周与Sham侧冈上肌相比无明显变化,但在术后2周和6周较Sham侧出现明显升高(P<0.01)。不同的HIFα亚型在肩袖损伤后肌肉中的表达不尽相同,在两种肩袖损伤模型的后期(术后6周),结果均显示HIF-3α的蛋白水平有很大程度的升高,并伴随着肌纤维横截面积的显著减小和脂滴堆积,表明损伤后的肌肉脂肪浸润和萎缩的严重程度可能与HIF-3α的表达增加有关。研究结论:肩袖损伤导致肩袖肌发生严重肌肉萎缩和脂肪浸润,且伴随着肩袖肌中血管密度显著降低,因此引起肩袖肌供血不足导致了损伤区域的低氧状态,使得HIFα亚型在肩袖损伤后不同时间点出现不同程度的变化,因此明确低氧对肌肉萎缩和脂肪浸润程度的影响,可在未来为治疗肩袖损伤后肩袖肌的退行性病变提供新的思路。