急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是由各种直接或间接原因引起的的肺实质细胞损伤,表现为弥漫性肺水肿,继而导致呼吸功能不全的临床急性危重症疾病。病原微生物感染导致的脓毒血症是引起ALI发病的重要危险因素之一,其具有两个主要病理生理学特征,分别为细胞因子风暴与免疫抑制。随着对ALI发生机制的研究越来越深入,抑制或逆转脓毒血症已成为防治ALI及其并发症的关键一环,但目前仍然缺乏特异性治疗措施。金合欢素(acacetin)是一类天然的黄酮类化合物,具有广泛的生物学活性,例如抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒以及抑制肿瘤增殖等。以往研究显示金合欢素可抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的氧化应激反应,抑制急性肺损伤的发展,但其机制仍未阐明。过度的炎症反应跟免疫细胞功能失调有关,免疫细胞的功能受NOD样受体家族(NOD-like receptors,NLRs)及其下游信号通路的调控。NLRC3(NOD-like receptor family CARD domain containing-3)作为NLRs家族成员,是负性调控免疫与增殖的重要分子之一。目前已有研究结果表明当LPS刺激巨噬细胞时NLRCNirmatrelvir说明书3显著下调,而完全敲除NLRC3后,与炎症反应密切相关的核因子kappa B(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路受到过度激活,导致大量的炎性介质产生。因此,抑制LPS引起NLRC3表达的异常降低可能有助于抑制炎症反应,防治脓毒血症引起的ALI,改善肺损伤病人的预后。本实验通过观察金合欢素在整体和细胞水平抑制脓毒血症引起的ALI的作用及其对NLRC3的影响,探讨金合欢素治疗ALI的可能机制。并进一步采用NLRC3基因敲除小鼠,在整体与细胞水平观察NLRC3在ALI中可能存在的作用,探讨相关的机制。通过该研究达到防治ALI的目的,为防治ALI提供新的思路与手段。金合欢素对ALI的防治作用及机制研究实验目的从整体和细胞两个水平观察金合欢素抑制脓毒血症引起的ALI,及其对NLRC3和NF-κB/NLRP3信号通路的影响,探讨金合欢素预防ALI发生和抑制过度炎症反应的机制。实验方法通过设置药物浓度梯度,挑选最佳的给药浓度。将小鼠或巨噬细胞分为3个组:对照组(Control)、LPS组(LPS)、给药组(LPS+A)。通过腹腔注射LLab EquipmentPS诱导小鼠ALI模型;计算肺湿干比和肺体比;肺组织切片HE染色观察病理改变并计算病理得分;实时定量PCR和Western Blot检测肺组织与细胞中炎性细胞因子、NLRC3、Sirt1、NLRP3的表达和NF-κB通路状态。实验结果(1)动物实验结果:金合欢素能够明显减轻脓毒血症引起的肺组织损伤,减少LPS引起的肺组织中炎性细胞因子增加。LPS抑制了小鼠肺组织中NLRC3和Sirt1的表达,可能通过促进NF-κB信号通路激活,使NLRP3表达增加。金合欢素能够上调NLRC3与Sirt1的表达,抑制NF-INCB28060半抑制浓度κB信号通路活化,下调NLRP3的表达。(2)细胞实验结果:LPS刺激引起RAW264.7中炎性细胞因子的表达增加,而金合欢素能够明显减少炎性细胞因子的表达。LPS抑制了RAW264.7中NLRC3和Sirt1的表达,并通过激活NF-κB信号通路,使NLRP3的表达增加。金合欢素通过上调NLRC3与Sirt1的表达,抑制NF-κB信号通路激活,减少NLRP3的表达。实验结论金合欢素在脓毒血症导致的ALI中,通过抑制NF-κB/NLRP3途径达到防治,其作用机制可能通过上调NLRC3与Sirt1的表达实现。NLRC3在ALI中的作用及机制研究实验目的从整体和细胞两个水平观察NLRC3在由脓毒血症引起的ALI中起到怎样的作用,及其对NF-κB信号通路的影响,探讨NLRC3抑制ALI发生发展的机制。实验方法将小鼠或原代培养的小鼠BMDM分为4个组:正常对照组(Control)、基因敲除对照组(NLRC3~(-/-))、LPS注射组(LPS)、基因敲除小鼠注射LPS组(LPS+NLRC3~(-/-))。通过腹腔注射LPS诱导小鼠ALI模型;计算肺湿干比和肺体比;肺组织切片HE染色观察病理改变并计算病理得分;肺组织MPO活性检测;肺组织切片免疫荧光染色;实时定量PCR与Western Blot检测细胞因子与Sirt1的表达以及NF-κB通路状态;ELISA检测BMDM培养上清中细胞因子的含量。实验结果(1)动物实验结果:急性肺损伤模型复制成功,NLRC3~(-/-)小鼠炎症症状更为明显,肺组织损伤严重。LPS导致小鼠肺组织中免疫细胞与炎性细胞因子含量增加,NLRC3和Sirt1表达受到抑制,促进NF-κB信号通路激活。NLRC3~(-/-)小鼠在LPS刺激后,肺组织中不仅炎性细胞因子含量显著增加并且巨噬细胞聚集增多,另外组织中Sirt1表达受到明显下调的同时NF-κB信号通路过度活化。(2)细胞实验结果:LPS刺激引起BMDM对炎性细胞因子的表达与分泌,同时下调了NLRC3和Sirt1的表达,促进NF-κB信号通路激活。NLRC3~(-/-)BMDM在LPS刺激后除了炎性细胞因子合成分泌显著增多以外,抗炎因子的合成分泌减少,Sirt1表达受到显著下调的同时NF-κB信号通路过度活化。实验结论NLRC3的变化在LPS诱导的ALI中起重要作用,这可能是通过抑制NF-κB信号通路的异常激活实现的。