酮病是围产期奶牛体内能量负平衡(Negative energy balance,NEB)而引发的营养代谢性疾病。酮病奶牛表现出严重的免疫抑制,在此期间,过度的脂肪动员增加了酮病奶牛血液中游离脂肪酸(Free fatty acids,FFA)的含量,增加炎性疾病的发生几率。巨噬细胞是机体内最关键的免疫细胞之一,它在维持体内免疫稳态中发挥着核心的作用,且在不同的刺激类型下可极化为促炎的M1表型或抗炎的M2表型巨噬细胞。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin,mTOR)介导的自噬是一种主要的废物降解过程,旨在维持细胞内稳态并保护免疫功能以应对应激条件。自噬与炎症反应和免疫功能呈负调控关系,但mTOR介导的自噬在酮病奶牛巨噬细胞免疫功能降低导致的炎性损伤中的作用机制尚不明确。本研究的目的是探讨mTOR介导的自噬对酮病奶牛巨噬细胞极化的影响。通过采集健康奶牛和临床型酮病(Clinical ketosis,CK)奶牛的血液样本,提取血液单核细胞并诱导为巨噬细胞,检测巨噬细胞极化的变化和巨噬细胞自噬状态。结果发现,与健康奶牛相比,CK导致M1标志物i NOS的蛋白表达增加而M2标志物Arg 1的蛋白表达降低,说明酮病奶牛M1表型巨噬细胞增加,M2表型巨噬细胞降低。CK奶牛巨噬细胞的自噬小体(黄色斑点)和自噬溶酶体(红色斑点)数量降低,说明酮病奶牛巨噬细胞自噬过程受损。通过体外培养奶牛巨噬细胞系,使用不同浓度的FFA并添加或不添加LPS和IFN-γ处理巨噬细胞系进行研究。结果显示,在0.3、0.6、1.2 m M FFA处理并添加或不添加LPS和IFN-γ组中磷酸化P65的蛋白表达水平及促炎因子TNF-α、IL-1selleck产品β及IL-6的m RNA表达水平显著增加。与0 m M FFA组相比,在0.3drugs and medicines、0.6、1.2 m M FFA处理并添加或不添加LPS和IFN-γ或IL-4和IL-10处理组中,CD86平均荧光强度和i NOS蛋白表达水平显著增加,同时CD206平均荧光强度和Arg 1蛋白表达水平显著降低。此外,在0、0.3、0.6和1.2 m M FFA并添加或不添加LPS和IFN-γ处理24 h后,巨噬细胞中自噬相关蛋白p-mTOR、p62蛋白表达水平在0.3、0.6、1.2 m M并添加或不添加LPS和IFN-γ组中显著增加,而LC3-II的蛋白表达水平显著降低。转染重组腺病毒MRFP-GFP-LC3 48 h,在1.2 m M FFA并添加或不添加LPS和IFN-γ处理24 h后自噬小体(黄色斑点)和自噬溶酶体(红色斑点)数量降低。以上表明,FFA诱导奶牛巨噬细胞自噬功能障碍,诱导巨噬细胞向M1表型极化,并激活炎症信号通路。为了研究mTOR介导的自噬对奶牛巨噬细胞极化的调控作用,在巨噬细胞系中添加mTOR激活剂MHY1485并添加LPS、IFN-γ或IL-4、IL-10,结果表明,MHY1485并添加或不添加LPS和IFN-γ处理增加了p-mTOR、p62蛋寻找更多白表达水平并降低了LC3-II蛋白水平。同时MHY1485和LPS、IFN-γ处理增加了i NOS蛋白表达水平和CD86平均荧光强度,MHY1485和IL-4、IL-10处理降低了Arg 1蛋白表达水平和CD206平均荧光强度。以上结果说明mTOR介导的自噬对奶牛巨噬细胞极化具有调控作用。为了研究mTOR介导的自噬、炎症反应和免疫功能之间的关系,在巨噬细胞系中添加mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)并添加或不添加LPS和IFN-γ。结果发现,RAPA预处理缓解了FFA诱导的p-mTOR及p62蛋白水平的增加,加剧了FFA诱导的LC3-II蛋白表达水平和自噬小体(黄色斑点)及自噬溶酶体(红色斑点)数量的降低;通过降低p-P65蛋白表达水平及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA表达水平,减轻了FFA诱导的炎症因子通路激活;此外,i NOS蛋白表达水平及CD86平均荧光强度的降低,缓解了FFA诱导的免疫抑制。这些结果说明高浓度的FFA使自噬功能受损,激活炎症途径,并诱导巨噬细胞向M1极化。综上所述,酮病奶牛巨噬细胞向M1极化增强且自噬通量受损。外源性FFA激活NF-κB炎症信号通路,诱导巨噬细胞向M1表型极化,并通过激活奶牛巨噬细胞中的mTOR信号通路抑制自噬活性。MHY1485通过激活mTOR信号通路抑制自噬,而RAPA对mTOR信号通路的作用相反。因此,增强mTOR介导的自噬可能为对抗酮病奶牛代谢挑战导致的免疫抑制提供思路。