卵巢癌(Ovarian cancer,OV)发病隐匿、类型复杂、预后不良,严重威胁女性生命健康,晚期卵巢癌五年生存率仅为30%-40%。RNA剪接是一种重要的基因转录后修饰过程,通过去除前体mRNA(pre-mRNA)内含子(intron),保留外显子(exon),产生成熟的mRNA。选择性剪接(Alternative Splicing,AS)作为RNA剪接重要组成部分,可分为外显子跳跃(Skipped Exons,SE)、内含子保留、互斥外显子、可变5’剪接和可变3’剪接等5种类型,对于基因功能调控具有重要作用。相比于正常组织,肿瘤组织中RNA剪接事件数量增加30%以上。前体mRNA的异常剪接可促进肿瘤的发生发展、复发转移与耐药产生。然而,肿瘤中发生的异常剪接事件及其促癌机制,由于剪接方式的复杂性、发生可变剪接基因的多样性以及研究方法的局限性,仍远未阐明,值得深入探索。本论文聚焦于卵巢癌中多聚谷氨酰胺结合蛋白1(Polyglutamine binding protein 1,PQBP1)的作用,采用整合RNA组学的方法,全方位探讨其作为剪接因子促进肿瘤发生发展的作用机制,构建其调控的可变剪接基因网络,同时针对下游关键基因异常剪接,设购买NSC 125973计反义寡核苷酸药物,并研究其在肿瘤治疗中的应用。本论文主要由以下三个部分组成:第一章:PQBP1在卵巢癌中的表达、临床意义及对肿瘤恶性行为的影响。通过转录组、蛋白质组学测序,我们发现PQBP1在多种肿瘤中存在mRNA 水平与蛋白水平高表达。在卵巢癌中,约10%的患者存在PQBP1基因拷贝数扩增,且PQBP1高表达与高肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden,TMB)正相关。随后,通过公共数据库与齐鲁医院标本库对其表达进行验证,并进行预后分析及单因素、多因素Cox回归分析,证明PQBP1高表达与卵巢癌分期、分级、大网膜转移、不良预后相关,PQBP1高表达与铂耐药是降低卵巢癌总生存期的独立风险因素。在上述研究的基础上,我们构建PQBP1敲低与过表达卵巢癌细胞系,并研究PQBP1对卵巢肿瘤细胞恶性生物学行为的影响。诱导性敲低PQBP1后,卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移能力降低,裸鼠皮下及腹腔成瘤能力明显下降,肿瘤重量、肿瘤生长速率均低于对照组,过表达PQBP1呈现相反的趋势。因此,体内外实验证实,PQBP1可发挥促癌基因的作用,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及体内成瘤。第二章:PQBP1通过调控BAX 2号外显子跳跃抑制卵巢癌凋亡机制研究。我们进一步探究PQBP1作为剪接因子结合在pre-mRNA的偏好性及调控的可变剪接事件。利用二代测序RNA-seq及SpyCLIP-seq技术分析,PQBP1主要结合在基因外显子区及剪接位点附近,即外显子与内含子交界处,调控外显子跳跃。三代全长转录组测序Nanopore-seq与RIP-seq技术进行验证,得到同一结论。外显子内含子富集峰分析显示,敲低PQBP1后,外显子3’端内含子保留减少,外显子跳跃增加。且PQBP1通过selleck产品与作用靶基因结合调控其表达,调控力度与结合峰丰度、数量与结合峰位置有关。KEGG通路分析显示,PQBP1直接结合且intracellular biophysics调控剪接的基因富集在细胞凋亡、RNA降解、RNA转运及mRNA监视等通路上。在PQBP1调控剪接且直接作用的靶基因中,我们聚焦于凋亡调控基因BAX(BCL2 Associated X),即BCL2家族中促凋亡基因的一员。其2号外显子跳跃会产生一种无义降解的短转录本(BAX-S)。而测序数据显示,PQBP1可通过直接结合BAX 2号外显子及1号内含子区域,促进2号外显子的跳跃,使全长BAX转录本(BAX-L)含量减少,BAX-S含量增加,从而降低BAX表达。Minigene,RIP-qPCR,RNA-pull down及RNA半衰期实验进一步验证该结论。TCGA,GSEA数据库及齐鲁医院标本分析发现,这种BAX基因的可变剪接产生的长短转录本在肿瘤与正常组织中存在差异表达,且BAX 2号外显子保留少的卵巢癌患者预后不良。随后,我们阐释了 PQBP1与线粒体凋亡的关系,在PQBP1敲低细胞系中,早/晚期凋亡细胞比例均上升,ROS水平升高,线粒体膜电位降低且线粒体最大耗氧率降低。过表达PQBP1可以拯救BAX造成的卵巢癌细胞凋亡及细胞增殖能力的降低。综上,PQBP1通过调控BAX 2号外显子可变剪接及表达,抑制细胞凋亡,促进卵巢癌恶性进程。第三章:靶向BAX 2号外显子的反义寡核苷酸药物在卵巢癌治疗中的研究。我们利用第二章报道的PQBP1结合基序,在BAX 2号外显子附近设计3条反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotide,ASO),并用硫代磷酸酯键修饰以增加其稳定性,对肿瘤细胞进行处理。其中,ASO1可以改变BAX2号外显子剪接模式,并诱导细胞发生凋亡。随后,动物实验结果也证明了 ASO1对肿瘤细胞的杀伤作用。综上所述,本论文探究RNA结合蛋白PQBP1在卵巢癌中的作用机制,结论如下:1.PQBP1在卵巢癌中高表达且与不良预后相关;2.PQBP1过表达促进肿瘤细胞增殖、侵袭,抑制其凋亡;3.PQBP1主要结合在前体mRNA剪接位点附近的外显子及内含子处,其调控下游靶基因表达的能力与结合位点丰度、数目、结合位置显著相关;4.PQBP1过表达促进BAX第2号外显子跳跃,产生无义降解的短转录本,进而下调BAX表达,抑制卵巢癌细胞凋亡;5.靶向BAX第2号外显子剪接的反义寡核苷酸能够改变BAX剪接模式,从而诱导卵巢癌细胞凋亡。本研究为卵巢癌早期诊断提供了新的靶点,进一步探讨了基因异常可变剪接在肿瘤恶性生物学行为中发挥的作用机制,靶向剪接的反义寡核苷酸药物分子量小,合成便捷,在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。