目的随着时代日新月异的发展及老龄化程度的不断加重,我国心血管病患病率及死亡率均呈现逐年上升的态势。心肌梗死是发展迅速且死亡率较高的心血管疾病之一,目前心肌梗死的有效治疗方法是通过药物及介入治疗的手段,虽然通过这些方法可以使阻塞的血管得到再通,但会对心脏产生缺血再灌注后的损伤,反而加重了病情的发展。在大多数疾病的发展过程中,存在着细胞死亡过程,细胞焦亡作为一种新发现的细胞死亡类型,它是一种程序性细胞死亡过程,常伴随着免疫炎症反应的发生。circRNA是一种环状RNA,结构通常稳定。通过近些年的研究,发现circRNA参与多种疾病的调控,包括部分肿瘤的发生及心脏相关疾病的调控。本文基于心脏缺血再灌注损伤与细胞焦亡为主要研究背景,探究circRNA参与心肌细胞焦亡的调控过程及相关分子机制,为降低心肌缺血再灌注后的炎症反应提供新的治疗手段和研究思路。方法本研究以小鼠乳鼠原代心肌细胞作为研究对象,通过体外缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)诱导细胞焦亡的发生,设置0 h、6 h、12 h、24h、48 h的缺氧时间梯度及复氧6 h的条件,筛选出诱导小鼠乳鼠原代心肌细胞发生焦亡的最佳时间点;高通量测序筛选H/R条件下差异表达的circRNA作为研究对象,利用实时荧光定量PCR检测显著差异表达基因,发现circRNA45524表达稳定且差异程度明显,因此将circRNA45524作为主要研究对象。核质分离法及荧光原位杂交selleck合成法检测circRNA45524在小鼠乳鼠原代心肌细胞内的分布;通过向小鼠乳鼠原代心肌细胞中转染si RNA与感染腺病毒,构建体外细胞敲低/过表达模型;Western Blotting检测细胞内焦亡相关蛋白的表达,LDH法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶的含量,衡量细胞死亡情况;PI染色法检测细胞死亡水平;免疫共沉淀法检测可能与circRNA45524结合的靶分子,并利用生物信息学,分析与circRNA45524相作用且参与细胞焦亡调控的靶点;最后通过分子蛋白间的互作验证来检测circRNA45524与下游靶点的关系。结果1.构建小鼠乳鼠原代心肌细胞H/R模型,模拟体外细胞焦亡过程,研究显示缺氧6 h,复氧6 h条件下细胞焦亡程度最明显。2.小鼠乳鼠原代心肌细胞H/R后,经过高通量测序及实时荧光定量PCR验证,circRNA45crRNA biogenesis524表达稳定且差异显著,因此将circRNA45524确定为主要研究对象。3.circRNA成环验证显示,circRNA45524具有环状结构。4.核质分离及荧光原位杂交结果显示,circRNA45524在细胞质与细胞核中均有分布。5.敲低小鼠乳鼠原代心肌细胞内的circRNA45524后,细胞焦亡标志性蛋白GSDMD、GSDMD-C的表达明显升高,焦亡通路相关蛋白Caspase-1、IL-1β的表达也明显升高,细胞上清液中LDH含量升高,PI染色阳性细胞数增多,因此敲低细胞内circRNA45524的表达加重细胞焦亡。6.过表达小鼠乳鼠原代心肌细胞中的circRNA45524并进行H/R处理后,细胞焦亡标志性蛋白GSDMD、GSDMD-C的表达明显降低,焦亡通路相关蛋白Caspase-1、IL-1β的表达也明显降低,细胞上清液中LDH含量降低,PI染色阳性细胞数减少,因此过表达细胞内的circRNA45524并在H/R条件诱导下,细胞焦亡过程被有效逆转。7.免疫共沉淀法检测显示,与Pull down NC组相比,Pull down circRNA45524组存在差异条带,表明可能存在与circRNA45524相互作用的分子。8.利用生物信息学分析及分子蛋白互作实验显示,circRNA45524与Drg2间存在相互作用关系,因此Drg2是下游机制研究的主要对象。结论本研究通过体外构建小鼠乳鼠原代心肌细胞H/R模型,探究circRNA45524对细胞焦亡的调控作用。结果表明,小鼠乳鼠原代心肌细胞在缺氧6 h复氧6 h的条件下细胞焦亡过程最明显。敲低小鼠乳鼠原代心肌细胞内的circRNA45524会加重细胞焦亡,过表达可以有效逆转细胞焦亡,且circRNA45524依赖Caspase-1—GSDMD细胞焦亡经典信号https://www.selleck.cn/products/ve-822.html途径对心肌细胞死亡过程进行调控。该研究结果阐明了circRNA45524调控H/R后心肌细胞焦亡的途径并提供了理论支撑,同时也为减轻心脏缺血再灌注后心肌细胞的损伤提供了思路和参考。