随着现代科学技术的不断发展,核能已经广泛应用于军事、医疗、能源、农业等领域,加之当前国际形式的复杂多变,核泄露事故的偶有发生,电离辐射(Ionizing radiation,IR)引起的放射性损伤越来越受到人们的关注。肠道细胞由于其快速增殖的特性,对辐射高度敏感,是放射损伤的主要靶器官之一。目前放疗仍然是许多肿瘤的重要辅助治疗手段,进行过腹部、骨盆或者直肠放疗的患者的肠道会受到一定程度的急慢性肠功能障碍。放射性肠炎的主要临床症状为腹泻、便血、脱水和因吸收障碍导致的营养不良等,很大程度上降低了放疗患者的生活质量。因此,放射性肠炎成为许多肿瘤放射治疗剂量的限制因素,目前还没有有效的防治手段。因此,深入研究放射性肠道损伤机制,找寻新SAG的靶点对攻克放射性肠损伤的治疗难关以及提高肠道在接受电离辐射时的耐受能力具有十分重要的意义。电离辐射会导致不同程度的损伤,其中最为核心的生物学效应的是DNA损伤,包括单链断裂和双链断裂。为应对电离辐射带来的DNA损伤,生物进化出一整套复杂的系统即DNA损伤应答反应(DNA damage response,DDR),包括从DNA损伤识别、细胞周期停止以进行DNA修复,最后到修复失败时的程序性细胞死亡或失活。相对于静止期的细胞来说,不断增殖的细胞对电离辐射更加敏感。增殖的细胞受到辐射损伤后,通过激活DDR来对细胞周期检查点进行调控,以便给与细胞更多的时间进行DNA修复。电离辐射导致的DNA双链或者单链断裂会分别迅速激活ATM和ATR。然后ATM和ATR将信号分别传递给Chk2和Chk1,激活Cdc25A、Cdc25C、Wee1,从而抑制周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)等来延缓细胞周期的进展。在DDR过程中,增殖的细胞一旦进入M期就难以再对DNA进行有效修复,所以延缓DNA受损的细胞进入M期的时间可以给与其更多的时间来进行DNA修复,这种周期阻滞主要发生在G1-S、S期和G2-M。如果细胞DNA修复不完全,可以发生增殖性死亡,即有丝分裂细胞死亡(mitotic cell death)。虽然目前已经对辐射后小鼠肠上皮细胞损伤修复进行了多年研究,但是现有的模型对于肠上皮细胞出现相关细胞周期阻滞的时间窗还不清楚。这个标记的核心就在于对处于S期不同时间和非S期的细胞能否结合时空变化,观察它们的DNA合成速率和细胞的分裂。因此,本课题研究中采用核苷类似物5-乙炔基-2-脱氧尿苷(2′-Deoxy-5-ethynyluridine,Ed U)提前对处于S期的细胞和G0/G1期的细胞进行标记和区分,利用流式细胞等技术,可以观察到先前观测点的S期细胞和G0/G1期的细胞的DNA含量的变化,对细胞周期运行方式进行图谱绘制,从而更精确的描述肠上皮细胞周期的动态变化,可以为多种损伤因素,尤其是放射导致的细胞周期阻滞和细胞分裂性死亡等方面通过精确的时间窗描述,同时对一些影响细胞周期的药物小分子提供更为精确的功能评估。主要研究结果及结论如下:1、通过该方法测得CCD 841 Co N细胞G0/G1、S、G2/M期持续时间分别为6小时、14小时、6小时。2、辐射早期可以使肠上皮细胞产生S期阻滞和G2/M期阻滞,且随着电离辐射剂量的增大,阻滞开始时间和持续时间更长,并且需要更长的时间来对DNA进行修复。但是2 Gy、4 Gy、6 Gy三个辐射剂量下并不会在早期导致明显的G1-S期阻滞。3、抑制m TOR可以使正常肠上皮细胞产生G1-S、S、G2/M阻滞,并且使辐射后的肠上皮细胞的G1-S阻滞和S期阻滞更明显。4、抑制CBS可以抑制隐窝细胞的增殖,使正常情况下的CCD 841 Co N细胞G1-S、S期和G2/M期阻滞,从而延缓肠上皮细胞细胞周Lapatinib分子式期运行。5、抑制ARPC2可以剂量依耐性地促进或抑制隐窝细胞增殖,使正常情况下CCD841 Co N细胞的G1-S和S期加速,G2/M期减缓。6、应用核苷类似物先期标记法检测小鼠隐窝处于细胞周期内的前体细胞在稳态下G0/G1期到S早期、S早期到S晚期、S晚期到分裂完成分别需要4小时、4小时、4小时。在辐射后4小时即可检测到S期和G2/M期阻滞,S阻滞rearrangement bio-signature metabolites结束时间为12小时,G2/M期阻滞在12小时达到高峰。7、通过CD24、CD44、GRP78的组合标记以及CD24表达含量的高低对隐窝细胞进行进一步细分,为下一步研究辐射对肠道干细胞周期的影响提供了新的思路。总之,本研究通过Ed U对细胞进行先期标记来区分干预因素前的细胞异质性,并结合表面标记物,可以对离体和在体的肠上皮细胞的周期运行和阻滞进行有效的观察。明确了人肠上皮细胞株和小鼠隐窝前体增殖细胞稳态下在不同细胞周期阶段的持续时间和辐射后细胞周期的阻滞时间。明确了m TOR、CBS、ARPC2三种细胞周期相关小分子对不同肠上皮细胞不同细胞周期阶段的影响,能够检测出常规方法不容易检测出的细胞周期运行和阻滞情况。利用此模型可以对其他具有增殖能力的细胞进行相应研究,为研究辐射造成多种类型细胞周期阻滞以及以细胞周期调控为靶点的药物筛选提供新的研究方法和策略。