抗生素长时间大规模的滥用导致广泛的细菌耐药现象,目前细菌耐药已成为严重的公共卫生问题,威胁人类的生命健康并带来巨大的社会经济负担,然而抗生素的研发却明显滞后,耐药菌所致感染缺乏有效的治疗手段,因此迫切需要开发新型抗菌药物。抗菌肽除具有多肽药物的优势外,还因其独特的作用机制、良好的抗菌活性、快速的杀菌作用以及较低的耐药倾向而成为抗菌领域的研发热点,具有良好的应用前景。Feleucin-K3(FLKLLKKLL-NH_2)和CPF-C1(GFGSLLGKALRLGANVL-NH_2)是两个从两栖类皮肤分泌物中分离提取的天然抗菌肽,二级结构均为α-螺旋构象的两亲性阳离子多肽,具有广谱的抗菌活性,对临床分离的细菌耐药株也显示出良好的抗菌活性,并且不易产生耐药性,是具有成药潜力的良好研究模板。但是作为天然线性肽,Feleucin-K3和CPF-C1均表现出稳定性较差,生物利用度不高的缺陷。在课题组前期研究中,对两个抗菌肽都分别进行了天然氨基酸取代、引入非天然氨基酸改造和引入拟肽小分子等方案进行寻找更多修饰,通过生物学活性检测筛选出了抗菌活性和稳定性获得提高的类似物。然而,这两个抗菌肽要研发成为抗菌先导化合物,还需进行成药性的优化改造,特别是稳定性仍需进一步提升。订书肽是通过在多肽侧链间形成共价桥连接,从而稳固α-螺旋活性构象,保护肽链免于被酶解的修饰技术,被证明是提高多肽稳定性的有效方法,并且获悉更多能够提高多肽的生理活性。本课题基于提高抗菌肽Feleucin-K3和CPF-C1稳定性和活性的目的,应用i+4烃类装订的改造方案,引入戊烯基氨基酸(α-四戊烯丙氨酸和2-四戊烯甘氨酸)并通过烯烃复分解反应(RCM)分别在两个多肽主链外将烯烃链连接形成共价桥,对亲本肽各位点进行扫描装订,合成了两个系列装订类似物,其中Feleucin-K3系列类似物8个,CPF-C1系列类似物17个,经质谱表征、纯化分析后对类似物进行了理化性质、抗菌活性、溶血活性和稳定性的检测,进行构效关系研究。实验结果显示,装订修饰后,两种类似物的活性构象α-螺旋的含量相比于亲本肽均有明显提升,例如Feleucin-Military medicineK3系列类似物FK3-S4的螺旋含量为95.19%(亲本肽Feleucin-K3的螺旋含量为64.97%),CPF-C1系列类似物CPF-S4的螺旋含量达95.23%(亲本肽CPF-C1的螺旋含量为71.35%)。在序列较短的Feleucin-K3系列中绝大多数类似物疏水性降低,而在序列较长的CPF-C1系列中疏水性则部分升高部分降低,与不同装订位点有关。同时两亲性变化也与装订位点有关,但未显示出明显规律。在抗菌活性方面,Feleucin-K3装订类似物中,大部分化合物抗菌活性有较大提升,对4种受试菌的MIC均为4μg/m L(亲本肽Feleucin-K3的MIC为8-32μg/m L),但也有少数类似物抗菌活性降低或丧失,CPF-C1装订类似物的抗菌活性与亲本肽相比没有明显改变。在本课题关注的稳定性方面,实验结果显示装订改造后,两个系列类似物的稳定性均获得明显提高,在生理盐环境中仍能保持原有的抗菌活性,在血清中的半衰期相比亲本肽显著提高,其中Feleucin-K3系列类似物FK3-S2的半衰期为40.28 h(T_(1/2)Feleucin-K3=3.53 h),CPF-C1系列类似物CPF-S9的半衰期达49.75 h(T_(1/2)CPF-C1=1.43 h)。溶血活性实验结果显示,两个系列类似物溶血活性均有一定程度升高。对化合物进行构效关系分析,课题证实了Feleucin-K3系列类似物保持4个正电荷数可以维持良好的抗菌活性,同时装订位点不能跨越两亲性界面,否则会打破亲疏水平衡使活性丧失,由于Feleucin-K3系列序列较短,其溶血活性主要受装订后显著提升的螺旋程度影响,后续的装订应着重调整螺旋程度从而降低溶血活性。对于序列较长的CPF-C1系列类似物,在装订位点扫描中根据结果推测第9和13位点可能是活性位点,替换会影响抗菌活性,同时由于其序列组成中疏水性和中性氨基酸残基占大多数,多肽整体更偏疏水性,所以带电荷数的减少、螺旋程度增加与疏水性界面延伸对其抗菌活性的影响较小,但是对溶血活性影响相对较大,后续装订需要适度引入亲水性氨基酸调节两亲性比例和增加带电荷数以提升抗菌活性,进而影响螺旋程度与疏水界面变化降低溶血活性。综上,本课题通过对Feleucin-K3和CPF-C1的各位点扫描装订,合成得到了两个系列共25个类似物,并进行理化性质、抗菌活性、溶血活性及稳定性的检测以及构效关系分析,后续深入精准的装订改造提供了理论和实验参考,为增加抗菌肽成药性,获得新型抗菌药物提供研究基础。