球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种典型的昆虫病原真菌,它具有寄主范围广、无毒害残留等特点,因此常被用作生物防治菌剂。在田间应用时,菌剂较弱的杀虫能力一直是制约其推广应用的重要原因之一。因此,如何有效地提高生防真菌杀虫效率是生防领域重点攻关的技术难题。特异性的组蛋白赖氨酸残基乙酰化作为染色质重塑导致转录改变的机制之一,能够使微生物适应感染宿主的应激条件。这种乙酰化常由多亚基的乙酰转移酶复合体催化,但在生防真菌中相关亚基功能尚不明确。本文中以转录激活因子Ada2和Ada3为切入点,通过农杆菌介导的真菌转化利用同源重组原理构建ΔAda2和ΔAda3敲除菌株,利用异位回补构建Ada2~C和Ada3~C回补菌株。通过比较WT与敲除菌株在实验中的表型差异,揭示Ada2和Ada3基因在球孢白僵菌菌丝生neonatal infection长、无性发育LEE011浓度、抗逆性及毒性等方面的功能,进一步解析Ada蛋白对Gcn5乙酰转移酶活的调控作用,本研究得出主要结论如下:1、Ada2和Ada3基因介导球孢白僵菌的菌丝生长和耐受性。在营养丰富的SDAY培养基上培养10 d时,Ada2或Ada3基因的缺失导致真菌生长明显减慢,相比于WT菌株,其菌落面积减少了59.99%和58.35%。在营养贫瘠的1/4 SDAY和CZA培养基上,ΔAda2突变体的菌落面积减少了37.32%和83.37%,ΔAda3突变体的菌落面积减少了44.32%和46.34%。而在13种CZA衍生培养基中,ΔAda2突变体的生长速度减少了78.21%-94.82%,ΔAda3菌株生长速度减少了31.36%-83.22%。ΔAda敲除菌株在添加化学胁迫的CZA培养基上也出现了生长缺陷。其中,在渗透胁迫(氯化钠和山梨醇)下,ΔAda2的耐受性下降了6.67%和9.22%,ΔAda3菌株的耐受性下降了11.10%和21.55%。在氧化应激(双氧水和甲萘醌)胁迫下,ΔAda2敲除菌株的敏感性提高了42.83%和32.13%,ΔAda3菌株的敏感性提高了25.34%和14.91%。在细胞壁破坏剂(刚果红和十二烷基硫酸钠)胁迫下,ΔAda2和ΔAda3菌株的耐受性下降了27.39%-45.21%。2、Ada2和Ada3基因影响球孢白僵菌的孢子产量和质量。显微镜观察不同菌株中孢子的形成发现WT菌株在培养5 d时生成一些孢子球和大量的孢子,而ΔAda敲除菌株只生成少量孢子。产孢实验测定不同菌株培养4～9 d的产孢情况,结果表明Ada2基因的缺失导致球孢白僵菌丧失了约98%的产孢能力,ΔAda3的产孢能力下降了57.07%-73.99%。ΔAda2和ΔAda3突变菌株在NLB培养基中培养3 d时,其生成芽生孢子的能力下降96.79%和54.59%。继续培养至4 d,ΔAda菌株生成芽生孢子的能力仍然下降95.85%和46.58%。此外,Ada基因的缺失使球孢白僵菌分生孢子质量和活力明显下降。在萌发实验中,ΔAda敲除菌株分生孢子萌发一半所需时间GT_(50)(h)是WT的1.15倍和1.38倍。在45℃的热激实验中,ΔAda2和ΔAda3敲除菌株的LT_(50)(min)下降57.06%和26.13%。3、Ada2和Ada3基因介导球孢白僵菌的毒力。在体壁侵染实验中,WT菌株处理的幼虫在7 d时已经完全死亡,而ΔAda2和ΔAda3处理过的幼虫全部存活,继续培养至10 d时存活率可达95.66%和85.56%。在血腔侵染实验中,对照菌株处理的幼虫在培养8 d时全部死亡,而ΔAda2和ΔAda3菌株处理的幼虫死亡率为3.27%和38.70%。在蝉翅穿透实验中,ΔAda敲除菌株在去除蝉翅的SDAY培养基中继续培养3 d均无法生成菌落进一步证明了ΔAda2和ΔAda3敲除菌株穿透能力严重减弱。Ada2和Ada3基因的缺失还使球孢白僵菌等量菌丝产生的胞外酶活下降了75.18%和82.01%,Pr1蛋白酶活下降了89.29%和37.02%。相似地,ΔAda敲除菌株中几丁质酶活性分别下降了58.22%和10.02%。4、Ada3-Ada2-Gcn5三聚体模型建立及Gcn5活性调节。酵母双杂实验表明Ada2蛋白与Ada3及Gcn5蛋白相互作用,且Ada3和Gcn5无相互作用,这表明球孢白僵菌体内存在Ada3-Ada2-Gcn5三聚体复合物。真菌/酵母Gcn5-HAT检测试剂Bafilomycin A1生产商盒的检测结果显示ΔAda2和ΔAda3中Gcn5酶活分别下降84.56%和40.35%,这表明Gcn5酶活依赖于Ada蛋白的调节作用。同时,Western blot实验结果也显示ΔAda2中乙酰化的组蛋白H3水平显著下降。在白僵菌中Ada3-Ada2-Gcn5三聚体共同作用影响组蛋白H3的乙酰化。综上所述,Ada蛋白通过影响Gcn5酶活性和组蛋白H3乙酰化水平来调节真菌的菌丝生长、无性发育、抗逆性和毒力。这些发现为了解昆虫病原真菌的生命周期以及Gcn5乙酰转移酶复合物在病原体中的作用机制提供新的思路,同时为生防真菌的菌株改良提供潜在的靶点。