研究背景及目的:肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85%,且大多数患者确诊时已为晚期,失去了根治性手术机会。免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)能为晚期NSCLC患者带来持久获益,开启了癌症治疗新时代。然而,丝氨酸/苏氨酸激酶11(Serine/threonine kinase11,STK11)突变的NSCLC患者对ICIs原发耐药。具体机制为,STK11突变会导致肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)失活,进而抑制干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)的活性,而STING的活化对抗肿瘤免疫至关重要。目前,STING激动剂已在临床前和临床研究中用于癌症免疫治疗,环状二核苷酸(Cyclic dinucleotides,CDNs)或CDN衍生物是一类代表性STING激动剂,但由于其生物利用度低,尚无法应用于临床。研究表明二甲双胍具有抗肿瘤效应,其主要通过活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路发挥作用,轴抑制蛋白1(selleckchem AlpelisibAxis inhibition protein 1,AXIN-1)是其激活AMPK的关键上游信号分子。研究报道二甲双胍对STK11突变型肺癌有益,并能增强化疗在这种癌症类型中的疗效。而且,二甲双胍能通过降低肿瘤耗氧增强抗肿瘤免疫,但其联合ICIs是否能克服STK11突变型非小细胞肺癌免疫治疗耐药尚不清楚。因此,本文旨在研究二甲双胍能否克服STK11突变型肺癌免疫耐药及其潜在机制。研究方法:使用H460细胞、A549细胞和AXIN-1敲除细胞(AXIN-1~(-/-)细胞)进行集落形成、细胞存活率和Ki67染色实验,探索二甲双胍联合T细胞或/和帕博利珠单抗的抗肿瘤效应。建立人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)-CDX小鼠模型进行体内实验。通过蛋白印迹、免疫荧光染色等实验探索二甲双胍对STING的表达及其下游信号通路的影响。利用CRISPR/Cas9敲除AXIN-1。通过I-TASSER服务器构建AXIN-1和STING的同源模型,Hex 8.0.0软件用于对接分析。免疫沉淀反应(Immunoprecipitation,IP)介导的内源性泛素化分析检测STING泛素化。非靶向代谢组学分析通过液相色谱-质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)/MS系统进行。研究结果:1、二甲双胍section Infectoriae在体内、体外均具有克服STK11突变型肺癌免疫耐药的效应。(1)我们首先进行T细胞介导的肿瘤细胞杀伤实验,通过集落形成、Ki67染色和细胞计数试剂盒(Cell counting Kit-8,CCK-8)实验证实二甲双胍增强了活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤。(2)通过Ki67染色进行的细胞实验和基于PBMCs-CDX小鼠模型进行的体内实验发现,二甲双胍联合程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)抑制剂在体外能显著抑制STK11突变型肺癌细胞的增殖,在体内能显著抑制STK11突变型肺癌移植瘤的生长,这些结果证实二甲双胍在体内外均具有克服STK11突变型肺癌免疫耐药的效应。2、二甲双胍依赖支架蛋白AXIN-1维持STING的稳定性,进而增强了活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤。(1)我们对实验动物的肿瘤组织进行蛋白印迹和免疫荧光染色分析,发现二甲双胍可显著增加蛋白STING的表达。通过环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)实验和蛋白印迹分析,我们发现二甲双胍可减缓STING的降解,在维持STING稳定性的同时活化其下游信号通路。在小干扰RNA敲低STING后,二甲双胍不能维持STING的稳定性,且不能增强活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤。(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除AXIN-1后,我们进行了集落形成试验、Ki67染色和CCK-8试验,发现二甲双胍不能增强活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤。同时,通过CHX实验,我们发现二甲双胍维持STING的稳定依赖于AXIN-1。在通过慢病毒转染AXIN-1~(-/-)细胞构建AXIN-1敲入细胞株后,我们证实二甲双胍维持STING的稳定性及增强活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤依赖于支架蛋白AXIN-1。3、二甲双胍通过增强AXIN-1与STING的结合,竞争性抑制环指蛋白5(Ring finger protein 5,RNF5)与STING的结合所介导的STING泛素化降解,从而维持STING的稳定性。(1)通过免疫荧光染色及激光共聚焦分析,我们发现AXIN-1与STING存在明显共定位且二甲双胍处理可增强这种作用,IP实验进一步证实二甲双胍可增Naporafenib研究购买强AXIN-1和STING的结合。蛋白质-蛋白质对接分析发现AXIN-1和STING在K150位点结合。(2)通过IP介导的内源性泛素化分析,我们首先明确二甲双胍减弱STING泛素化降解,然后进行蛋白印迹和免疫沉淀分析鉴定出E3泛素连接酶RNF5,并证实二甲双胍依赖AXIN-1抑制RNF5介导的K48链接的STING泛素化降解而维持STING的稳定。4、二甲双胍依赖AXIN-1上调多种核苷酸,且这些核苷酸化合物能增强活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤,可能与二甲双胍克服STK11突变型肺癌免疫耐药相关。(1)我们进一步通过非靶向代谢组学分析从代谢角度探索二甲双胍克服STK11突变型肺癌免疫耐药的代谢机制,结果发现二甲双胍依赖AXIN-1上调多种核苷酸。(2)细胞实验证实这些核苷酸化合物促进了活化T细胞对STK11突变型肺癌细胞的杀伤。这些结果表明,二甲双胍依赖AXIN-1上调的多种核苷酸可能与二甲双胍克服STK11突变型肺癌免疫耐药相关。研究结论:二甲双胍具有克服STK11突变型肺癌免疫耐药的效应,其机制是通过依赖支架蛋白AXIN-1抑制RNF5介导的K48链接的STING泛素化降解,从而维持STING的稳定并活化其下游信号通路。并且,通过非靶向代谢组学分析,我们发现二甲双胍依赖AXIN-1可上调多种核苷酸,它们可能与二甲双胍克服STK11突变型肺癌免疫耐药相关。