种子休眠和萌发是植物特有的两个生理过程,对植物生长和作物生产至关重要。甜瓜(Cucumismelo L.)作为我国最重要的园艺作物之一,其种子萌发涉及众多复杂的生理生化反应。植物脱落酸(ABA)作为一种可以调控种子萌发的关键激素,具有良好的农业应用潜力。然而,ABA调控甜瓜种了萌发的分子机制月前尚不清楚。本课题组前期利用一个黄化突变体材料M166图位克隆了调控甜瓜叶绿体发育的关键基因CmGLK,并构建了一年生薄皮甜瓜HB42背景下的Cmglk近等基因系。在此研究基础上,我们以HB42和Cmglk近等基因系glk-NIL为试验材料,统计分析两种甜瓜种子萌发速率的差异;利用外源ABA和ABA合成抑制剂Fhuridone处理HB42和glk-NIL种子,分析外源ABA对甜瓜种了萌发速率的影响:基于转录组结果筛选出和ABA信号通路相关并且为Prebiotic activityABA受体的CmABAR基因,同源转化甜瓜验证CmABAR基因功能,并利用Y1H、LUC、EMSA等实验分析CmGLK和ABA受体基因NSC125066试剂CmABAR的关系。主要研究结果如下:1.我们对HB42和glk-NIL种子的萌发速率进行了比较分析,结果显示在培养基中播种2天后,HB42种子的明发速率达到95%,而glk-NIL种子的发芽率仅达到56%,显著低于HB42种子的萌发速率,说明CmGLK基因可能参与调控种子萌发的过程。2.我们选择HB42和glk-NIL种子萌发速率差异最为明显的时期测定内源ABA含量,发现glk-NIL种了内源ABA含量几乎是甜瓜野生型材料HB42的2倍,说明ABA含量差异是导致glk-NIL的萌发速率显著低于HB42野生型材料的原因。用ABA处理HB42种子,其萌发速率与对照(未经ABA处理的HB42种子)相比显著降低;用ABA合成抑制剂Fhuridone处理glk-NIL种子,与对照(未经Fluridone处理的glk-NIL种子)相比萌发速率显著升高。以上结果表明CmGLK基因通过ABA途径调控种子的萌发速率。3.在HB42和glk-NIL种子萌发速率差异最明显的时期进行转录组测序分析,筛选得到1933个差异表达基因(DEGs)。其中,上调差异表达基因825个,下调差异表达基因1108个。在这些DEGs中,ABA信号通路上相关的基因有31个,这些基因大多数为ABA受体、与种子萌发相关,其中ABA合成相关并且为ABA受体的CmAZD9291抑制剂ABAR基因在glk-NIL中表达量显著下调,且该基因在拟南芥中的同源基因AtABAR突变体表型和拟南芥双突变体glkIglk2-表型一致,均表现为黄化的表型。4.我们利用Y1H(Yeast one-hybrid)和 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)实验证明CmGLK能够结合CmABAR启动子;双荧光素酶报告分析(Dual-Luciferase reporter assay,LUC)结果显示,CmGLK为转录激活了,能增强CmABAR启动子的活性。利用同源重组法构建35S-CmABAR-GFP融合蛋白表达载体转化本氏烟草叶片表皮细胞,亚细胞定位结果显示CmABAR基因定位于叶绿体膜中。GUS染色和灾光定量PCR实验结果表明CmABAR基因参与甜瓜种了萌发的调控。5.构建CmABAR基因的过量表达载体,采用农杆菌介导法转化甜瓜glk-NIL;同时构建CmABAR基因的CRISPR-CAS9基因敲除载体,转化野生型甜瓜材料XZM和VED。目前已获得一株CmABAR基因的CRISPR-CAS9杂合编辑植株。后续会观察不同转基因植株的表型,比较过表达、CRISPR-CAS9转基因植株种子与各自对照植株种子在萌发速率方面的差异,解析CmABAR基因调控种子萌发的生物学功能。以上结果表明CmGLK可能通过与CmABAR基因启动子上的G-box元件结合,促进甜瓜种子的萌发,导致甜瓜种子萌发速率的升高。