目的:锰(Manganese,Mn)是广泛存在于地壳的金属元素,同时也是人体的必需微量元素之一。职业暴露或者环境暴露于过量锰会产生神经毒性,表现为类似帕金森病的症状,称为锰中毒。线粒体损伤在锰的神经毒性中发挥重要作用,生理条件下线粒体的结构,功能,数量总是维持在相对稳定的状态,称为线粒体稳态。为了维持线粒体稳态和应对线粒体损伤带来的一系列严重后果,细胞进化出了多层次的线粒体质量控制系统,其中在细胞器水平上主要由两个相反的机制来共同维持:依靠线粒体自噬清除损伤或者功能障碍的线粒体,依靠线粒体生物发生产生新的、健康的线粒体。但是,锰对线粒体稳态的影响及其分子机制还尚未完全阐明。本课题组之前的研究表明,锰可以导致巨自噬相关蛋白发生巯基亚硝基化(S-nitrosylation,SNO),干扰自噬的活化。而PTEN诱导的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)也是非常容易发生亚硝基化的蛋白之一,它的正常功能对于维持线粒体稳态至关重要。据此我们推测:锰可以干扰神经细胞线粒体稳态导致线粒体损伤,而锰对线粒体稳态的调控可能与PINK1发生蛋白亚硝基化有关。为了验证以上推测,我们首先利用Wistar大鼠建立锰中毒动物模型,来探究不同剂量的锰暴露对大鼠神经细胞线粒体稳态的影响;其次,利用体外培养的原代神经元并使用诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS/NOS2)特异性抑制剂1400W来验证PINK1蛋白亚硝基化在锰诱导的原代神经元及其线粒体损伤中的作用;最后,我们从线粒体生物发生以及线粒体自噬两个方向出发,进一步探究PINK1蛋白亚硝基INCB28060研究购买化干扰神经细胞线粒体稳态具体的分子机制。研究方法:1、成年Wistar大鼠64只,按照体重随机分为4组,每组16只,雌雄各半,分别为对照组,低锰组,中锰组,高锰组。对照组腹腔注射生理盐水,低、中、高剂量染锰组分别腹腔注射15、30、60mg/kg的氯化锰(Mn Cl_2)溶液,连续染毒6周。通过检测大鼠神经行为学改变和脑内纹状体锰含量来检验锰中毒动物模型是否成功建立。通过检测神经细胞早期凋亡率、ROS水平、线粒体途径凋亡相关蛋白的表达水平来评价大鼠神经细胞损伤情况,通过检测线粒体膜电位、线粒体ROS(mt ROS)、ATP水平、以及神经元线粒体超微结构来评价大鼠神经细胞线粒体损伤情况,通过检测线粒体自噬相关蛋白的表达水平以及线粒体与自噬囊泡的共定位水平来评价大鼠神经细胞线粒体自噬水平。通过检测线粒体生物发生相关蛋白和m RNA的表达水平以及线粒体DNA拷贝数来评价大鼠神经细胞线粒体生成水平。最后检测各组PINK1的蛋白亚硝基化水平及其下游蛋白ZNF746和Parkin的磷酸化水平。2、体外培养原代神经元,分别用0,50,100,200μM的Mn Cl_2处理0、6、12、18、24h,进行细胞活力和毒性检测,结合神经元形态学改变确定后续实验中锰剂量为100和200μM,处理时间为24h。为了验证PINK1的蛋白亚硝基化是否参与锰诱导的神经元损伤,我们用NOS2抑制剂1400W来作为干预,将细胞进行如下分组:对照组(培养液),低锰组(100μM Mn Cl_2),高锰组(200μM Mn Cl_2),1400W对照组(20μM 1400W),低剂量1400W干预组(10μM 1400W+200μM Mn Cl_2),高剂量1400W干预组(20μM 1400W+200μM Mn Cl_2)。通过检测NOS2活力和NO的生成水平来探究锰处理后PINK1发生蛋白亚硝基化的机制,通过检测神经元早期凋亡率、ROS水平、线粒体途径凋亡相关蛋白的表达水平来评价锰和1400W预处理后原代神经元的损伤情况,通过检测线粒体膜电位、线粒体ROS(mt ROS)、ATP水平、以及神经元线粒体网络形态来评价锰和1400W预处理后原代神经元线粒体的损伤情况。3、为了探究锰诱导的PINK1蛋白亚硝基化干扰神经元线粒体稳态的分子机制,我们检测了锰和1400W预处理后ZNF746蛋白及m RNA的表达水平、ZNF746的泛素化水平及磷酸化水平、PINK1和ZNF746蛋白之间的相互作用、ZNF746的核转位水平及其与PGC-1α启动子之间的相互作用、线粒体生物发生相关蛋白及m RNA的表达水平以及线粒体DNA拷贝数,以上指标用来评价锰诱导的PINK1蛋白亚硝基化对于神经元线粒体生成的影响。接下来我们检测了锰和1400W预处理后PINK1与Parkin蛋白之间的相互作用、Parkin的磷酸化水平、p-Parkin向线粒体的转位情况、线粒体与自噬囊泡的共定位水平、线粒体与溶酶体的共定位水平、线粒体自噬相关蛋白的表达水平,以上指标用来评价锰诱导的PINK1蛋白亚硝基化对于神经元线粒体自噬的影响。结果:1、锰暴露组大鼠出现明显的神经行为学异常表现,脑锰含量也显著增加,这都说明大鼠锰中毒模型成功建立。与对照组相比,锰暴露组大鼠神经细胞及其线粒体出现明显损伤。此外,大鼠的神经细胞线粒体生成水平在低锰组和中锰组明显升高,在高锰组中明显降低,说明低剂量锰暴露可以激活线粒体生物发生,而高剂量锰暴露抑制线粒体生成。而不同剂量的锰暴露都能活化线粒体自噬;但是与中锰组相比,高锰组的线粒体自噬水平出现明显下降,说明高剂量锰暴露阻碍了线粒体自噬的活化。与对照组相比,高锰组大鼠纹状体神经细胞内PINK1蛋白亚硝基化水平明显上升;与中锰组相比,ZNF746和Parkin的磷酸化水平selleck合成都有一定程度的下降。说明高剂量锰暴露导致PINK1蛋白亚硝基化,抑制其激酶活力导致下游蛋白(ZNF746和Parkin)的磷酸化水平下降。2、与对照组相比,200μM锰处理组原代神经元NOS2活力、NOS2蛋白表达量、NO生成水平、PINK1蛋白亚硝基化水平都明显增加,说明锰可以激活NOS2产生大量NO,使PINK1发生蛋白亚硝基化,而1400W可以通过抑制NOS2的活力,减少锰诱导的NO生成,进而缓解高剂量锰诱导的PINK1蛋白亚硝基化。与对照组相比,锰处理组神经元的ROS生成、早期凋亡率、线粒体途径凋亡相关蛋白的表达都明显增加,说明锰处理造成了原代神经元损伤。此外,锰处理组神经元的mt ROS生成、线粒体膜电位以及ATP生成水Tregs alloimmunization平都明显增加,并且出现明显的线粒体网络碎片化,说明锰处理造成了原代神经元线粒体损伤;与200μM锰处理组相比,1400W干预组的原代神经元损伤及其线粒体损伤程度明显降低,说明1400W可以缓解锰致原代神经元及其线粒体损伤。3、与对照组相比,线粒体生成水平在100μM锰处理组中均明显升高,在200μM锰处理组中明显降低。200μM锰诱导的PINK1蛋白亚硝基化降低了其对下游蛋白ZNF746的磷酸化水平及其泛素化降解,导致细胞中ZNF746蛋白表达水平增加并且进入到细胞核中抑制PGC-1α启动子的转录水平进而影响线粒体生物发生。而线粒体自噬水平在锰处理组中均明显升高,但是200μM锰却明显抑制了线粒体自噬的活化。200μM锰诱导的PINK1蛋白亚硝基化降低了其对下游蛋白Parkin的磷酸化水平及其线粒体转位,影响了线粒体与自噬囊泡的融合以线粒体与溶酶体的融合,进而阻碍了线粒体自噬的活化。与200μM锰处理组相比,1400W干预组的线粒体生成水平和线粒体自噬水平明显增高,说明1400W可以通过缓解PINK1蛋白亚硝基化减轻高剂量锰对线粒体稳态的干扰。结论:锰诱导的PINK1蛋白亚硝化通过降低其下游蛋白ZNF746的磷酸化与泛素化水平,导致ZNF746表达增加并入核抑制PGC-1α/NRF1/TFAM介导的线粒体生物发生;同时降低Parkin的磷酸化及其线粒体转位,从而阻碍了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的活化。