布鲁氏菌病是一种常见的慢性人畜共患病,由布鲁氏菌侵入机体引起,对公共卫生和畜牧业造成巨大危害。布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,IV型分泌系统(Type IV secretion systems,T4SS)作为其重要毒力因子,可以至少分泌15种效应蛋白来发挥作用。效应蛋白作用于宿主细胞内的重要信号通路,抑制宿主先天免疫应答,促进布鲁氏菌在细胞内的存活与繁殖,引起慢性持续感染。有研究报道,T4SS分泌的效应蛋白BspF调控宿主分泌运输,加速布鲁氏菌的胞内复制。BspF具有一个GNAT(GCN5-Related N-Acetyltransferases)家族的乙酰转移酶结构域,猜测其可能具有巴豆酰转移酶活性。课题组前期通过体外酶活实验对BspF的酶活性进行验证,证实BspF在体外具有乙酰转移酶活性和去巴豆酰转移酶活性;通过巴豆酰化修饰组学分析发现BspF能够改变细胞内1525个不同蛋白上的5559个巴豆酰化位点的修饰,并发现p53蛋白在BspF的影响下巴豆酰化修饰减弱。p53作为一个转录因子可以调节下游基因的表达,促进细胞凋亡。因此猜测布鲁氏菌可能通过翻译后修饰宿主细胞蛋白来干扰宿主细胞的凋亡途径,避免病原体被nocardia infections机体的免疫系统清除,从而促进布鲁氏菌的胞内生存,并造成持续性感染。本文主要研究效应蛋白BspF对p53凋亡途径的影响以及BspF在布鲁氏菌感染过程中对细胞凋亡的影响。在本研究中,为了探索BspF调节细胞凋亡的具体机制,首先通过免疫共沉淀验证出BspF可以减弱p53巴豆酰化修饰,并鉴定出效应蛋白BspF与p53蛋白发生相互作用。随后将BspF影响p53的巴豆酰化位点进行突变使其丧失发生巴豆酰化修饰的功能,构建p53K351A突变体并验证了BspF可以特异性地去除p53K351的巴豆酰化修饰。进一步验证了BspF通过降低p53K351位点的巴豆酰化修饰,从而影响p53整体的巴豆酰化修饰水平。并且通过转染BspFΔGNAT(GNAT结构域缺失)重组质粒,以说明BspF对p53的去巴豆酰化修饰作用依赖于GNAT乙酰化转移酶结构域。此外,还发现在细胞内过量表达BspF会降低p53蛋白的表达水平,通过Western blot实验进一步研究发现BspF通过影响p53 K351位巴豆酰化修饰影响其表达量且依赖于GNAT结构域。布鲁氏菌S2308野生株和2308ΔbspF缺失株感染细胞后,通过Western blot实验以及荧光定量PCR实验检测线粒体凋亡相关因子Bax、AIF、p53、Caspase-3的蛋白表达和mRNA转录水平,发现与S2308野生株相比,ΔbspF缺失株促进这些凋亡因子的蛋白表达和mRNA转录。随后利用Western blot实验以及荧光定量PCR实验检测BspF在细胞内过量表达对这些凋亡相关因子的蛋白表达和mRNA转录水平的影响,发现效应蛋白BspF抑制这些凋亡因子在细胞内的表达和转录并依赖其GNAT结构域。流式细胞术selleck合成结果显示,Belnacasan体内ΔbspF缺失株感染后的细胞凋亡率与野生型S2308株相比更高。ΔbspF缺失株在细胞内生存能力比S2308野生株更弱。综上所述,效应蛋白BspF通过特异性地去除p53K351巴豆酰化修饰以降低其在细胞中的表达量,从而减少凋亡相关因子的mRNA转录和蛋白表达,抑制宿主细胞凋亡。本研究发现了布鲁氏菌对凋亡通路调控起到关键作用的效应蛋白,并且创新地引入巴豆酰化修饰这一重要的蛋白质翻译后修饰,为阐明布鲁氏菌通过分泌效应蛋白调控宿主细胞凋亡实现促进增殖提供了全新的机制。