FvNPR1蛋白对采后草莓果实抗病性的调控机制研究

草莓果实酸甜多汁、营养可口,深受大众的喜爱。但其极易遭受机械损伤和病原微生物感染而发生腐烂,使草莓在贮运保鲜过程中损失严重。为了减少病害造成的损失、提高质量,化学杀菌剂被广泛应用,但由于化学杀菌剂存在耐药性的问题,同时农药残留可能会引发一系列的食品安全问题,所以,化学杀菌剂的使用受到了一定的限制。因此草莓果实采后如何抑制病原菌的侵染成为急需解决的问题。本论文以我国广泛种植的经济性果实草莓为实验材料,以激发子(BTH和BR)诱导的采后草莓果实抗病反应中TGA与NPR1Bemcentinib细胞培养蛋白、FvFLS2/FvBAK1/FvBIK1受体复合物的调控作用以及互作机制为主线,研究NPR1蛋白和FvBAK1转录因子在草莓果实抗病网络中的调控作用,研究结果如下:(1)研究了草莓TGA家族的鉴定及与NPR1蛋白的相互作用分析。结果显示,在四倍体森林草莓(Fragaria vimmune sensoresca)的基因组数据库中检索得到17个草莓TGA家族成员,其不均匀分布在草莓的7条染色体上,基因长BAY 73-4506溶解度度大部分都介于6~7.96 kb,可编码蛋白长度为147~545 aa,分子量为17.04~60.29 kD,等电点为5.77~8.92,不稳定系数为39.05~67.1,脂肪指数为50.44~96.28。这些编码蛋白大多为不稳定亲水性蛋白,不含跨膜结构域,且都是核定位蛋白。根据草莓系统进化树,将其分为5个亚族,草莓TGA家族成员主要聚类在Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ亚族上,少数聚类在Ⅲ亚族上。草莓TGA家族成员启动子顺式作用元件具有相似性,均含有胁迫应激响应元件和植物激素应答元件。FaNPR1蛋白的基因保守结构域上含有BTB结构域和3个ANK重复序列,氨基酸序列中含有一个核定位信号和7个二硫键。可以推断,BTH处理草莓果实可诱导SAR反应和提高细胞还原势,进而FaNPR1蛋白由细胞质转入细胞核与草莓TGA转录因子相互作用,启动下游PRs基因的表达,激活了priming防御反应增强了草莓果实抵御病原菌入侵的防御抗病能力。(2)研究了BR处理对采后草莓果实腐烂和品质的影响。结果显示,5μM~50μM的BR诱导子可以抑制草莓果实采后的腐烂现象,特别是浓度为10μM的BR可以显著限制灰葡萄孢霉的发展。自然腐烂在贮藏后期急剧增加,B.cinerea对草莓果实的侵染性较强,BR处理可以显著降低了草莓果实的发病率及病斑直径,同时降低灰霉病的侵染速度。B.cinerea的侵染严重影响了草莓果实的采后贮藏品质,BR处理可以控制TA、TSS、硬度及相应感官品质的下降,同时促进总花色苷、总酚等抗氧化物质含量的积累,加快DPPH自由基清除率的上升,有效提高了草莓果实的抗氧化能力,提高采后果实的整体品质。这些结果说明,BR处理对采后草莓果实采后腐烂和品质具有一定的影响,BR可以诱导提高草莓果实的抗病性,从而减轻灰霉病的发生。在草莓的保鲜上选择恰当浓度的BR处理十分重要,因为不同的果蔬和组织对BR处理的浓度和方式要求略有不同,因此在绿色激发子BR的应用上,探索适当的浓度和处理方式会使其在保鲜领域具有更好的发展前景。(3)研究了FvFLS2和FvBAK1的受体样激酶复合物参与BR诱导的草莓果实采后免疫。结果显示,FvFLS2、FvBAK1和FvBIK1是三个质膜定位激酶,它们参与BR诱导草莓果实抗性的过程,根据酵母双杂交试验,FvBAK1在酵母细胞中与FvFLS2、FvBIK1和FvRBOHD发生物理相互作用。在接种BR诱导下,草莓果实中NPR1、PR1、PR2和PR5基因及ROS都不断积累增加。在B.cinerea侵染期间,BR处理的草莓果实中ROS爆发和SA依赖的防御反应增强。BAK1的过表达促进了ROS的积累和BR诱导的防御反应,而BAK1功能缺失的突变体则损害了BR诱导的SA信号传导和对坏死性真菌病原体的免疫。BAK1、SA信号通路和BR诱导的对B.cinerea的疾病抗性呈正相关。这些结果说明,FvBAK1与下游底物BIK1进一步形成受体复合物,并根据B.cinerea诱导的PTI反应诱导RBOHD转录。FvBIK1和FvRBOHD之间的相互作用有助于FvRBOHD依赖的ROS爆发,该ROS在暴露于坏死真菌的采后草莓果实PTI反应过程中增强SA信号。说明了FvBAK1作为FvBIK1上游调控因子和FvFLS2共受体在建立草莓果实采后PTI信号转导中的重要性。