农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transVP-16化学结构formation,ATMT)是一个天然的转化工具,基于其较高的转化效率,正被广泛应用于植物与微生物的遗传转化中。尖孢镰刀菌(FusariuCL13900化学结构m oxysporum)是引起三七根腐病的一种重要致病菌,对三七的产量与品质造成不可预估的损失。为了解尖孢镰刀菌生长发育以及致病的分子机制,本研究以三七根腐病原菌-尖孢镰刀菌作为材料,通过优化ATMT体系提高转化效率,构建尖孢镰刀菌T-DNA插入突变库。从盐胁迫、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫、氧化胁迫、产孢能力和孢子萌发率几个方面着手,筛选出与野生型差异较大的突变体。利用热交换不对称PCR扩增出其侧翼片段,确定T-DNA插入位点序列,进而有效挖掘与胁迫和生长发育相关基因。主要结果如下:1.将携带卡那霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因标记的质粒p Camhyggfp转入农杆菌LBA4404中,用其对野生型尖孢镰刀菌进行农杆菌介导的遗传转化。对影响转化效率的共培养条件如农杆菌培养时间、尖孢镰刀菌和脓杆菌共培养时间、共培养温度、尖孢镰刀菌孢子浓度等转化条件进行优化。利用优化后的转化体系,得到了600个突变体。对得到的突变体进行了潮霉素抗性验证及潮霉素抗性基因PCR鉴定,突变体都能在含潮霉素的平板上生长,PCR能扩增出1000 bp左右的目的条带,表明外源T-DNA已经插入到尖孢镰刀菌基因组中。2.对突变株进行形态学、盐胁迫、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫、氧化胁迫、产孢能力和孢子萌发率分析。在盐胁迫下,突变株Δ11与野生型生长状态有较大差别。在细胞壁胁迫下,突变株Δ3、Δ7、Δ11、Δ12生长相较于野生型明显被抑制。在细胞膜胁迫下,突变株Δ11、Δ12、Δ320、Δ336生composite hepatic events长相较于野生型明显被抑制,甚至不生长。在氧化胁迫下突变株Δ3、Δ320、Δ336相较于野生型生长被抑制,当浓度增加到0.1 M H_2O_2时,抑制效果更加明显,突变株甚至不生长。突变株Δ7和Δ336相较于野生型孢子产量明显下降。突变株Δ3、Δ7、Δ320和Δ336相较于野生型孢子萌发率均有所降低。3.提取突变株基因组,利用热交换不对称PCR(TAIL-PCR)对上述6个突变体分别进行了插入位点侧翼片段扩增,共成功获得了6条侧翼序列。测序后经过BLAST比对分析,其中Δ320插入序列定位于尖孢镰刀菌古巴专化型1号染色体上,没有获取到更多信息。Δ12插入序列与编码尖孢镰刀菌4287 GTP结合蛋白Rho2序列有99%相似性。Δ336插入序列与编码尖孢镰刀菌4287靶向雷帕素(TOR)亚基LST8序列有99%相似性。Δ3、Δ7和Δ11插入序列均为编码未知功能的假定蛋白基因。农杆菌介导的遗传转化技术在尖孢镰刀菌分子水平研究上打开了新视角,尖孢镰刀菌突变体库的成功构建有利于发掘未知功能基因,为研究尖孢镰刀菌生长发育和致病机制奠定了基础。