目的:在肿瘤微环境中,肿瘤细胞、基质细胞和免疫系统细胞之间的相互作用,导致肿瘤微环境的细胞成分向促进肿瘤恶性进展的方向改变。肿瘤微环境在细胞恶性进展、免疫逃避和治疗抵抗中发挥关键作用。肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤微环境中最丰富的一种细胞类型,对肿瘤发生和肿瘤微环境起中心调控作用。巨噬细胞通过产生细胞因子、趋化因子和生长因子来影响血管内皮细胞、树突细胞、成纤维细胞和T细胞等的功能,其造成的免疫抑制微环境是肿瘤治疗失败的关键原因。因此,重塑肿瘤相关巨噬细胞来改变肿瘤微环境,已成为治疗肿瘤的有效策略。IFN-γ是促进抗肿瘤免疫的关键介质,在抗肿瘤免疫中发挥了关键作用。IFN-γ可诱导巨噬细胞向M1型极化并抑制肿瘤生长,然而具体的作用机制还有待进一步阐明。细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是一种非经典的细胞周期蛋白,由CCNG2基因编码,可以负性调控细胞周期,阻碍细胞周期的进程。Cyclin G2在各种癌细胞中发挥肿瘤抑制因子的作用,然而其在免疫细胞中的作用还未见报道。鉴于巨噬细胞在肿瘤微环境中的核心调控作用,本研究主要探讨在IFN-γ作用下巨噬细胞中cyclin G2在体内外对肿瘤进展的作用及其分子机制,为肿瘤的靶向治疗提供理论基础。研究方法:1.检测cyclin G2在不同类型巨噬细胞中的表达:将THP-1细胞、人外周血单核细胞和小鼠骨髓来源的单核细胞诱导成不同类型巨噬细胞,使用RT-q PCR和Western blot检测cyclin G2的表达。2.明确巨噬细胞regular medication中cyclin G2对体内肿瘤生长的影响:将结肠癌细胞MC38或肺癌细胞LLC与WT或Ccng2~(-/-)C57BL/6小鼠的骨髓来源巨噬细胞混合,皮下接种于C57BL/6小鼠右背侧。合适时间腹腔注射IFN-γ,定期测量肿瘤大小。3.评估巨噬细胞中cyclin G2对细胞毒性T细胞趋化及杀伤能力的影响:采用免疫组化染色、免疫荧光染色和流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中细胞毒性T细胞的数量。此外,通过细胞毒性T细胞的趋化实验评估巨噬细胞中cyclin G2对细胞毒性T细胞趋化的作用,流式细胞术检测细胞毒性T细胞颗粒酶B和穿孔素的表达。4.评估巨噬细胞中cyclin G2对血管生成的影响:采用免疫组化染色检测小鼠肿瘤组织中血管的数量。体外成管实验探究巨噬细胞中cyclin G2对血管内皮细胞成管能力的作用。5.验证CXCL9是cyclin G2发挥作用的下游效应分子:通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测敲除cyclin G2后CXCL9的分泌水平,将CXCL9重组蛋白加入至巨噬细胞的条件培养基中,采用细胞毒性T细胞的趋化实验以及血管内皮细胞的成管实验进行验证。6.探究cyclin G2调控CXCL9分泌的机制:采用RT-q PCR检测巨噬细胞CXCL9的m RNA表达,通过Western blot检测STAT1和p-STAT1(Y701)的表达水平,核质分离实验以及免疫荧光染色评估STAT1在细胞质和细胞核的分布。7.明确PP2Ac是参与cyclin G2调控STAT1核含量的关键分子:通过免疫沉淀(IP)研究cyclin G2、STAT1以及PP2Ac三者的关系。敲低PP2Ac后,通过Western blot检测STAT1和p-STAT1(Y701)的表达水平,核质分离实验以及免疫荧光染色评估STAT1在细胞质和细胞核的分布。结果:1.IFN-γ能够上调巨噬细胞cyclin G2的表达。2.IFN-γ通过cyclin G2发挥抑制结肠癌和肺癌的作用:将结肠癌或肺癌细胞分别与WT或Ccng2~(-/-)小鼠骨髓来源巨噬细胞混合后皮下接种于小鼠右背侧,合适时间腹腔注射IFN-γ,构建皮下成瘤模型。与WT组相比,Ccng2~(-/-)组的肿瘤重量和体积显著增加,并且Ccng2~(-/-)组Ki-67的阳性细胞数显著增多。结果表明敲除cyclin G2可以减弱IFN-γ对结肠癌和肺癌的抑癌作用。3.巨噬细胞敲除cyclin G2减少对细胞毒性T细胞的招募:与WT组肿瘤组织相比,Ccng2~(-/-)组中细胞毒性T细胞的数量明显减少。趋化实验证明Ccng2~(-/-)组处理的细胞毒性T细胞趋化能力减弱。结果表明巨噬细胞敲除cyclin G2减少细胞毒性T细胞的募集,从而减弱了IFN-γ的抑癌作用。4.巨噬细胞敲除cyclin G2促进肿瘤血管生成:与WT组肿瘤组织相比,Ccng2~(-/-)组中血管的数量明显增加。成管实验证明Ccng2~(-/-)组处理的血管内皮细胞成管能力增强。结果表明巨噬细胞敲除cyclin G2促进了血管生成,从而减弱了IFN-γ的抑癌作用。5.巨噬细胞中cyclin G2通过CXCL9调节细胞毒性T细胞趋化和血管生成。与WT组相比,Ccng2~(-/-)组中CXCL9的分泌减少。回复实验验证CXCL9是cyclin G2发挥作用的下游效应分子。6.Cyclin G2通过促进STAT1核转位上调CXCL9的m RNA表达。与selleck NMRWT组相比,Ccng2~(-/-)组中CXCL9的m RNA表达下调。此外,敲低cyclin G2后,p-STAT1(Y701)的蛋白表达下调,STAT1的核含量降低。结果表明cyclin G2通过STAT1调控CXCL9的转录。7.Cyclin G2介导的STAT1核转位依赖于PP2Ac:STAT1与cyclin G2都与PP2Ac存在相互作用,并且敲低cyclin G2时STAT1结合PP2Ac的含量增加。此外Regorafenib临床试验,与对照组相比,敲低PP2Ac上调了p-STAT1(Y701)的表达,STAT1的核含量得到回复。结果表明cyclin G2以PP2Ac依赖的方式增加STAT1的核含量。结论:1.IFN-γ能够上调巨噬细胞cyclin G2的表达,并通过cyclin G2发挥抑制结肠癌和肺癌的作用。2.Cyclin G2以PP2Ac依赖的方式促进STAT1核转位来上调CXCL9的m RNA表达,进而使CXCL9的分泌增加,导致细胞毒性T细胞的募集和抑制血管生成,最终抑制肿瘤。